新型抗凋亡分子hPEBP4作為人前列腺癌治療靶點的實驗研究.pdf

1、前列腺癌是歐美國家男性最常見的惡性腫瘤之一，在我國也有上升趨勢。對于晚期及轉(zhuǎn)移的前列腺癌，目前還沒有有效的治療方法。凋亡是很多化療藥物發(fā)揮作用的機(jī)制，如果凋亡途徑發(fā)生異常，將會導(dǎo)致一些腫瘤細(xì)胞對化療藥物不敏感。因此，如何提高藥物的凋亡誘導(dǎo)率，降低副反應(yīng)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性成為目前研究的熱點。 磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine-bindingprotein，PEBP)蛋白是一類能與磷脂

2、酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)結(jié)合的蛋白。該家族的所有成員都含有與PE結(jié)合的保守區(qū)域(PBP)。hPEBP4為本實驗室從人骨髓基質(zhì)細(xì)胞中克隆到的新型磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族成員。RT-PCR結(jié)果顯示hPEBP4在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的研究表明hPEBP4能通過抑制Ras/Raf/MEK1/ERK1/2途徑、JNK活化和PE外翻來抑制TNFa誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

3、，這些功能均由其PE結(jié)合保守區(qū)域(PBP)介導(dǎo)。作為抗凋亡分子，干擾hPEBP4的表達(dá)可以促進(jìn)TNFa誘導(dǎo)的凋亡和細(xì)胞周期阻滯。提示hPEBP4可能是治療乳腺癌的作用靶點。hPEBP4作為抗凋亡分子和腫瘤治療的靶點是否具有普遍性意義以及在其它腫瘤中的作用機(jī)制如何?本文就hPEBP4在TRAIL誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞凋亡中的作用及其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。 第一部分.hPEBP4在人前列腺癌PC-3細(xì)胞中過表達(dá)對TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的

4、作用及機(jī)制探討首先，組織芯片研究發(fā)現(xiàn)hPEBP4選擇性的表達(dá)于前列腺癌腫瘤組織，并且與前列腺癌組織的分化程度具有相關(guān)性。前列腺癌分化越低，hPEBP4表達(dá)越高，提示該分子在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮作用。利用RT-PCR和測序確認(rèn)hPEBP4在三種常見前列腺癌細(xì)胞系中的分布：結(jié)果顯示hPEBP4在對TRAIL不敏感的LNCaP中高表達(dá)，而在對TRAIL敏感的PC-3、DU145中不表達(dá)。提示hPEBP4可能在抵抗TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞

5、凋亡中發(fā)揮作用。 因此，我們選擇不表達(dá)hPEBP4的PC-3細(xì)胞，構(gòu)建并穩(wěn)定篩選出過表達(dá)hPEBP4及PBP功能域缺失的突變體p75PEBP4的細(xì)胞株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組和突變組相比，hPEBP4能夠抑制TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而p75PEBP4沒有此功能。PI3-K/Akt和MAPK是研究的比較廣泛的信號通路，在腫瘤細(xì)胞對TRAIL產(chǎn)生抵抗性中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。尤其是已有研究資料表明持續(xù)性活化的Akt是前列腺癌對TRAIL產(chǎn)

6、生抵抗性的重要原因。因此，我們進(jìn)一步對hPEBP4在前列腺癌中的抗凋亡機(jī)制進(jìn)行探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PC-3細(xì)胞中過表達(dá)hPEBP4能夠明顯促進(jìn)Akt的活化并抑制TRAIL誘導(dǎo)的ERK1/2活化。過表達(dá)hPEBP4對TRAIL誘導(dǎo)的JNK、p38的活化沒有影響。PI3-K的抑制劑不僅能夠完全抑制Akt的活化，還能夠部分逆轉(zhuǎn)hPEBP4對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的抑制作用，說明hPEBP4抑制TRAIL誘導(dǎo)的凋亡作用部分依賴于Akt的活化。p75P

7、EBP4沒有上述功能，進(jìn)一步說明hPEBP4在PC-3人前列腺癌細(xì)胞中的抗凋亡作用是由PBP保守區(qū)域介導(dǎo)的。 在前列腺癌細(xì)胞中，TRAIL通過線粒體依賴的方式進(jìn)一步激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)來誘導(dǎo)凋亡。該過程中的任意環(huán)節(jié)發(fā)生異常都會引起TRAIL抗性的產(chǎn)生，同時活化的Akt可以通過作用多種底物來抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤生長。因此我們進(jìn)一步研究了過表達(dá)hPEBP4對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)hPEBP4能夠抑制

8、TRAIL誘導(dǎo)的BID的裂解和Caspase3的活化，但是對Caspase8和Caspase9的活化以及DR4、DR5的表達(dá)都沒有影響；同時過表達(dá)hPEBP4能夠抑制TRAIL誘導(dǎo)的抗凋亡分子Bcl-2/Bcl-xL的降解和促凋亡分子BAD的表達(dá)而對Bax等其它Bcl-2家族成員沒有影響；過表達(dá)hPEBP4還能夠抑制TRAIL誘導(dǎo)的p27kip1的表達(dá)而對p21waf/cip1沒有影響。PI3-K的抑制劑能夠完全抑制Akt的活化，部分逆

9、轉(zhuǎn)hPEBP4過表達(dá)對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。以上結(jié)果提示，hPEBP4過表達(dá)對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響至少部分依賴于Akt的活化來實現(xiàn)。說明hPEBP4過表達(dá)通過活化Akt，進(jìn)而調(diào)控下游凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來抑制TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且該作用是由PBP保守區(qū)域介導(dǎo)。 第二部分.阻斷hPEBP4在人前列腺癌LNCaP細(xì)胞中表達(dá)對TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制探討在第一部分研究中，我們發(fā)現(xiàn)hPE

10、BP4在LNCaP細(xì)胞中高表達(dá)，而在PC-3和DU145中不表達(dá)。在PC-3細(xì)胞中過表達(dá)hPEBP4能夠抑制TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此我們考慮在LNCaP細(xì)胞中阻斷hPEBP4的表達(dá)是否會增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性?我們利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了持續(xù)特異性阻斷hPEBP4表達(dá)的穩(wěn)定篩選細(xì)胞株，從反向來研究hPEBP4對TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示在LNCaP前列腺癌細(xì)胞中，阻斷hPEBP4表達(dá)能夠促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的

11、細(xì)胞凋亡。同時發(fā)現(xiàn)阻斷hPEBP4的表達(dá)能夠抑制Akt的活化，促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的ERK1/2的活化。MEK1抑制劑部分抑制了阻斷hPEBP4對TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。提示hPEBP4表達(dá)下調(diào)對TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用部分依賴于ERK1/2的活化。結(jié)合第一部分的實驗結(jié)果，提示hPEBP4可能通過調(diào)節(jié)Akt和ERK1/2信號通路抑制TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 在以往的研究中我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中hPEBP4受到T

12、NF-α刺激后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜并與Raf-1和MEK1競爭性結(jié)合，抑制Raf-1/MEK1/ERK1/2通路的活化。那么在前列腺癌細(xì)胞中hPEBP4在接受TRAIL刺激后是如何作用的呢?接下來我們用共沉淀和免疫沉淀的方法證實了不論是PC-3細(xì)胞過表達(dá)的外源性hPEBP4，還是LNCaP細(xì)胞本身高表達(dá)的hPEBP4，在TRAIL刺激后都能與Raf-1和MEK1結(jié)合，但不結(jié)合PI3-K的p85和p110亞基，也不結(jié)合Akt。提示hPEBP4在T

13、RAIL刺激后有可能轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜與Raf-1和MEK1結(jié)合，抑制Raf-1/MEK1/ERK1/2通路的活化。但是hPEBP4是如何調(diào)節(jié)Akt的活化目前仍不清楚，還有待深入研究。 越來越多的研究表明復(fù)雜的信號通路之間存在著交叉活化，PI3-K/Akt和MAPK通路之間也同樣存在。目前對于兩者之間交叉活化的研究還不甚明了，有證據(jù)表明兩者之間的相互調(diào)控都具有復(fù)雜的雙向性。我們在過表達(dá)hPEBP4的PC-3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PI3-K的抑制劑

14、對TRAIL誘導(dǎo)的ERK1/2的活化沒有影響，而在hPEBP4表達(dá)下調(diào)的LNCaP細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MEK1的抑制劑能夠部分逆轉(zhuǎn)阻斷hPEBP4表達(dá)對Akt活化的抑制作用。綜上提示，hPEBP4可能以某種方式直接調(diào)節(jié)Akt的活化，同時在接受外界刺激后還可以通過調(diào)節(jié)Raf-1/MEK1/ERK1/2通路間接調(diào)控Akt的活化。 接下來我們觀察了阻斷hPEBP4的表達(dá)對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻斷hPEBP4表達(dá)能夠促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)

15、的BID的裂解和Caspase3的活化，但是對Caspase8和Caspase9則沒有影響；同時阻斷hPEBP4表達(dá)能夠促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的抗凋亡分子Bcl-2/Bcl-xL的降解和促凋亡分子BAD的表達(dá)而對Bax等其它Bcl-2家族成員沒有影響；阻斷hPEBP4表達(dá)還能夠促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的p53的穩(wěn)定性的增強(qiáng)和p27kip1的表達(dá)而對p21waf/cip1沒有影響。MEK1的抑制劑能夠部分逆轉(zhuǎn)阻斷hPEBP4表達(dá)對TRAIL誘導(dǎo)的凋

16、亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。以上結(jié)果提示，阻斷hPEBP4表達(dá)對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響至少部分依賴于ERK1/2的活化來實現(xiàn)。說明阻斷hPEBP4表達(dá)通過活化ERK1/2，進(jìn)而調(diào)控下游凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。結(jié)合第一部分結(jié)果提示hPEBP4可能通過調(diào)控Akt和ERK1/2信號通路，進(jìn)而調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 研究表明，Akt活性的增強(qiáng)和ERK1~活性的降低是前列

17、腺癌預(yù)后不良的標(biāo)志，而hPEBP4恰好能夠同時調(diào)控Akt和ERK1/2通路的活化。同時組織芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)hPEBP4與前列腺癌的惡性分化具有相關(guān)性，提示hPEBP4在低分化前列腺癌中的表達(dá)有可能通過調(diào)控Akt和ERK1/2的活化引起前列腺癌治療的失敗，導(dǎo)致預(yù)后不良。hPEBP4可能是一個很好的前列腺癌治療的靶點。 綜上所述，hPEBP4通過調(diào)節(jié)Akt和ERK1/2信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來抑制TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。