新生大鼠高氧性肺損傷肺組織中AQPl、α-ENaC、SP-A的蛋白和mRNA表達(dá)及呋塞米霧化的干預(yù)作用.pdf

1、目的:
　　1.建立新生大鼠高氧肺損傷的動(dòng)物模型;
　　2.觀察和比較高氧性肺損傷時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織病理學(xué)改變,以及水通道蛋白-I(AQPl)、鈉通道(α-ENaC)、肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(SP-A)的mRNA及其蛋白的表達(dá)變化,從而探討AQPK a-ENaC、SP-A在急性高氧性肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用;
　　3.探討呋塞米霧化是否通過調(diào)控AQPI、α-ENaC、SP-A的表達(dá)從而發(fā)揮對(duì)高氧肺損傷的保護(hù)作用,為臨床防

2、治高氧性肺損傷提供理論依據(jù)。
　　方法:將110只出生一天內(nèi)的新生Sprague Dawiey(SD)大鼠(雌雄不限)隨機(jī)分為三組:I組:空氣組(對(duì)照組,n=37);Ⅱ組:高氧組(高氧+生理鹽水霧化, n=37);Ⅲ組:干預(yù)組(高氧+呋塞米霧化,n=36)。
　　Ⅰ組新生大鼠置于空氣中飼養(yǎng)。Ⅱ組、Ⅲ組新生大鼠置于氧濃度維持在95％左右的氧箱中飼養(yǎng)。Ⅲ組于實(shí)驗(yàn)第一天起霧化吸入呋塞米(lmg/kg, qod),兩天一次,共計(jì)七次

3、。II組于實(shí)驗(yàn)第一天起同時(shí)間點(diǎn)霧化等量生理鹽水。
　　每組按實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)分為3天、7天、14天三個(gè)亞組,并于各實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物十二只,處死取材檢測(cè)以下指標(biāo):
　　(1)肺泡灌洗液中總蛋白含量;
　　(2)左肺稱取濕、干重,計(jì)算肺濕/干重比值;
　　(3)右上肺行病理切片后,觀察肺組織病理改變;
　　(4)肺組織AQPl, α-ENaC, SP-A蛋白及mRNA含量測(cè)定:取相應(yīng)肺組織提取蛋白,通過Wes

4、tern Blotting方法測(cè)定其蛋白含量;另外取相應(yīng)肺組織提取RNA,通過RT-PCR方法測(cè)定m RNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1.各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況觀察:Ⅰ組(空氣組)中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反應(yīng)好,生長發(fā)育正常。Ⅱ組(高氧組)中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物逐漸出現(xiàn)癥狀,表現(xiàn)為皮毛無光澤,精神反應(yīng)欠佳,脫氧后煩躁不安,呼吸困難明顯,唇周發(fā)紺,其中一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。而Ⅲ組(干預(yù)組)中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般活動(dòng)情況較高氧組明顯改善,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無死亡。
　　2.肺

5、組織病理學(xué)改變:Ⅰ組(空氣組)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)肺組織肺泡大小均一,肺泡腔內(nèi)未及液體滲出、細(xì)胞浸潤。Ⅱ組(髙氧組)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在高氧暴露3天后,肺泡腔擴(kuò)大,肺血管擴(kuò)張充血,肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)紅細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤。7天后可見肺組織水腫,結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡內(nèi)出血、液體滲出、炎癥細(xì)胞浸潤明顯加重,部分肺間隔增寬變形,肺組織結(jié)構(gòu)紊亂。14天時(shí)更為明顯,肺組織結(jié)構(gòu)紊亂,肺間隔明顯增厚,出現(xiàn)纖維化表現(xiàn),肺泡數(shù)量明顯減少,肺泡腔明顯增大,可見肺大泡。Ⅲ組(干預(yù)組)肺

6、組織各時(shí)相形態(tài)與結(jié)構(gòu)改變均較高氧組明顯減輕。
　　3.肺組織濕/干重比(W/D):在實(shí)驗(yàn)3天、7天、14天時(shí), Ⅱ組(高氧組)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織W/D較I組(空氣組)有升髙(P<0.05),而Ⅲ組(干預(yù)組)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織W/D較I I組(高氧組)明顯降低(PC0.05)。
　　4.支氣管肺泡灌洗液(BLAF)中總蛋白(TP)含量測(cè)定:在實(shí)驗(yàn)3天、7天、14天時(shí), Ⅱ組(高氧組)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的BLAF中TP含量明顯高于Ⅰ組(空氣對(duì)照組

7、)(P<0.05),Ⅲ組(干預(yù)組)的BLAF中TP含量則明顯低于II組(高氧組)(<0.05)。
　　5.肺組織中AQP1,α-ENaC, SP-A蛋白表達(dá)水平的變化:
　　(1)在實(shí)驗(yàn)第3天、7天時(shí),Ⅱ組(高氧組)肺組織AQPl蛋白表達(dá)水平較I組(空氣組)下降明顯(P<0.01),14天時(shí)Ⅱ組(高氧組)肺組織AQPl的蛋白表達(dá)水平較前增加,但較Ⅰ組(空氣組)仍有下降(p<0.055)。m組(干預(yù)組)肺組織AQPl蛋白表達(dá)水

8、平在實(shí)驗(yàn)3天、7天及14天時(shí)均與Ⅰ組(空氣組)接近,明顯高于Ⅱ組(高氧組),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　(2)在實(shí)驗(yàn)第3天、7天及14天時(shí),Ⅱ組(高氧組)肺組織Oi-ENaC的蛋白表達(dá)水平較I組(空氣組)明顯下降(P<0.05),而m組(干預(yù)組)肺組織a-ENaC蛋白表達(dá)水平較Ⅱ組(高氧組)明顯升高,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　(3)在實(shí)驗(yàn)第3天時(shí),Ⅱ組(髙氧組)肺組織SP-A蛋白表達(dá)水平較I(空

9、氣組)及Ⅲ組(干預(yù)組)明顯升高(P<0.05),在實(shí)驗(yàn)第7天、14天時(shí)表達(dá)較I(空氣組)及Ⅲ組(干預(yù)組)明顯下降(P<0.05),而Ⅲ組(干預(yù)組)肺組織SPA蛋白表達(dá)水平與I組(空氣組)接近,兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　6.肺組織中AQPl, α-ENaC, SP-A的mRNA表達(dá)水平的變化:在本實(shí)驗(yàn)中,通過RT-PCR方法檢測(cè)顯示:
　　(1)在實(shí)驗(yàn)第3天、7天及14天時(shí),Ⅱ組(高氧組)肺組織AQPl及αa-E

10、NaC的mRNA表達(dá)水平均較I組(空氣組)明顯下降(P<0.05),Ⅲ組(干預(yù)組)肺組織AQPi及α-ENaC的mRNA表達(dá)水平稍低于I組(空氣組)(p>0.05),明顯高于Ⅱ組(髙氧組),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肺組織中AQPl的mRNA表達(dá)水平與α-ENaC的m R N A表達(dá)行相關(guān)性分析,提示兩者呈正相關(guān)關(guān)系,直線等級(jí)相關(guān)系數(shù)為0.451(p<0.01)。
　　(2)在實(shí)驗(yàn)第3天時(shí),Ⅱ組(高氧組)肺組織中SP-A的

11、mRNA表達(dá)水平較I組(空氣組)明顯升高(P<0.05),在實(shí)驗(yàn)第7天、14天時(shí)Ⅱ組(高氧組)肺組織中SP-A的mRNA表達(dá)水平較I組(空氣組)明顯下降(P　　結(jié)論:1.暴露于高氧中可致新生大鼠發(fā)生肺損傷,并隨暴露時(shí)間的延長肺損傷

12、漸加重。主要病理表現(xiàn)為肺組織水腫、結(jié)構(gòu)紊亂、肺泡內(nèi)出血、炎性細(xì)胞浸潤,肺泡數(shù)目減少,肺泡間隔增厚及纖維化等。
　　2.高氧性肺損傷時(shí),AQPl及 a-ENaC的蛋白及mRNA的表達(dá)水平較正常對(duì)照組中相應(yīng)蛋白及mRNA的表達(dá)水平下降,與肺水腫的程度相一致,提示AQPl、α-ENaC的蛋白及mRNA的表達(dá)水平的變化在急性高氧性肺損傷的肺水腫的形成中起著重要作用。
　　3.高氧性肺損傷時(shí),SP-A蛋白及m RNA表達(dá)水平呈先增高后