腫瘤克隆起源之爭與甲狀腺乳頭狀癌研究.pdf

1、甲狀腺癌(thyroid carcinoma)是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，約占人類新發(fā)惡性腫瘤的1％。近年來，甲狀腺癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，最新的Cancer Statistics，2009數(shù)據(jù)顯示，美國甲狀腺癌數(shù)以每年6.2％速度遞增，首次超過卵巢癌發(fā)病率成為女性第七大常見惡性腫瘤。
　　 甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中包含一系列高發(fā)的分子遺傳學(xué)事件，如甲狀腺濾泡狀癌中的RAS基因突變、與甲狀腺乳頭狀癌和部分甲狀腺腺瘤相關(guān)的R

2、ET/PTC基因重排、以及在甲狀腺未分化癌中常見的p53基因突變等。BRAF基因突變是近年來在甲狀腺癌研究領(lǐng)域最突出的進展之一，其主要的突變方式是發(fā)生在15號外顯子的BRAFV600E突變，在甲狀腺乳頭狀癌中的平均發(fā)生率為44％。研究表明，BRAFV600E突變是甲狀腺癌發(fā)生早期的分子遺傳學(xué)事件，與腫瘤腺外浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期晚等都有顯著的統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)，在臨床上有很大的研究價值和運用前景。國內(nèi)研究僅停留在較小樣本的臨床病理特征比較

3、上，尚無大樣本研究隊列（超過200例）和長時間臨床隨訪來研究BRAFV600E突變在中國人群中甲狀腺癌的發(fā)生情況及預(yù)后價值。
　　 甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma, PTC)是甲狀腺癌最常見的病理類型，其臨床特征之一是病灶多發(fā)，文獻報道的發(fā)生率從18％-87％不等，多灶性甲狀腺乳頭狀癌通常被認(rèn)為與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及初次治療后局部復(fù)發(fā)率高有密切關(guān)聯(lián)。雙側(cè)甲狀腺乳頭狀癌（同時性或異時性），

4、作為一種特殊類型的多灶癌，其克隆起源尚未被報道過，該類型的臨床病理特征也未被重點研究過。
　　 第一部分：BRAF基因突變在我國甲狀腺癌人群中的研究
　　 目的：研究BRAF基因突變在我國甲狀腺癌人群的發(fā)生情況，并進一步探索其在預(yù)測疾病復(fù)發(fā)和生存中的價值。
　　 方法：建立我院十年甲狀腺癌數(shù)據(jù)庫（含甲狀腺癌1006例），進行中位時間6年的電話隨訪和信訪（最短2.5年，最長13.5年）。入組BRAF基因研究隊列含甲

5、狀腺癌220例（乳頭狀癌208例、濾泡狀癌8例、髓樣癌1例、未分化癌3例），良性甲狀腺病變46例。在比較并優(yōu)化石蠟組織基因組DNA抽提方法的基礎(chǔ)上，以直接測序法檢測BRAF基因15號外顯子的突變情況（BRAFV600E突變）。
　　 結(jié)果：BRAFV600E突變集中發(fā)生在甲狀腺乳頭狀癌中，突變率55.3％(115/208)：在甲狀腺癌的其他病理類型及良性甲狀腺病變組織中均未檢測到該突變。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)BRAFV600E突變與發(fā)病

6、年齡密切相關(guān)(P=0.004)；長期隨訪結(jié)果顯示該突變與疾病總生存率接近統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.068)。
　　 結(jié)論：BRAFV600E突變在我國甲狀腺癌人群同樣集中在甲狀腺乳頭狀癌，且有相對較高的發(fā)生率；另外該突變可能與甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)后不良相關(guān)。
　　 第二部分：雙側(cè)甲狀腺乳頭狀癌的克隆起源研究
　　 目的：研究甲狀腺乳頭狀癌同時性雙側(cè)病灶及異時性復(fù)發(fā)病灶之間的克隆起源。
　　 方法：入組25對雙側(cè)甲

7、狀腺乳頭狀癌病灶（22對同時性的雙側(cè)病灶和3對異時性的復(fù)發(fā)病灶）以及15個轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。以手工顯微微切割腫瘤組織，從石蠟組織抽提基因組DNA；運用PCR和直接測序法檢測成對病灶之間的BRAF基因狀態(tài)；聯(lián)合更為準(zhǔn)確的X染色體失活分析技術(shù)判斷腫瘤克隆起源。
　　 結(jié)果：21對病例的62個病灶獲得合格的DNA樣品，18對病灶(18/21,85.7％)的BRAF基因狀態(tài)完全一致，其中BRAF基因突變組12對、BRAF基因野生型組6對。18

8、例女性病例中的11對病灶適合作X染色體失活分析，9對雙側(cè)病灶(9/11,81.1％)的X染色體失活形式相同。BRAF基因突變比較和X染色體失活分析在判斷腫瘤克隆起源結(jié)果上一致性好(Chi-Square, two-sided P=0.026； Spearman's rank correlaTiO2 test, r=0.671)。
　　 結(jié)論：基于甲狀腺癌發(fā)生相關(guān)的BRAF基因突變比較與胚胎時期就已確立的X染色體失活技術(shù)的聯(lián)合，本研

9、究首次證實甲狀腺乳頭狀癌雙側(cè)病灶（同時性和異時性）系同一克隆起源，腫瘤腺內(nèi)播散可能是雙側(cè)甲狀腺癌發(fā)生的重要原因。這一發(fā)現(xiàn)為臨床進一步認(rèn)識甲狀腺癌的生物學(xué)行為和合理治療甲狀腺癌（甲狀腺全切）提供重要依據(jù)。
　　 第三部分：新型BRAF基因插入突變的初步研究
　　 目的：在雙側(cè)甲狀腺癌克隆起源研究中，我們通過測序篩查發(fā)現(xiàn)了一例極為罕見的插入型BRAF基因突變——BRAFV599Ins突變，該突變僅在一例意大利人群的甲狀腺癌病

10、人中被報道過。本部分研究擬初步探索該插入型突變可能獲得的生物學(xué)功能。
　　 方法：回顧性檢測該患者所有病灶的BRAF基因突變情況，以TA克隆確認(rèn)該突變類型。構(gòu)建該罕見插入型BRAF基因突變（BRAFV599Ins突變）以及常見的BRAFV600E突變和BRAF基因野生型真核表達載體，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時后，檢測BRAF蛋白及下游ERK信號通路的表達水平，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化，WST-8法(CCK-8)檢測細(xì)胞增殖情