甲狀腺乳頭狀癌病理診斷和預(yù)后相關(guān)分子標(biāo)記物及多發(fā)癌灶克隆起源的研究.pdf

1、甲狀腺乳頭狀癌是惡性上皮性腫瘤顯示濾泡細(xì)胞分化的形態(tài)和特征性的核。甲狀腺乳頭狀癌總體預(yù)后良好，術(shù)后10年無病生存率超過90％，但仍有低于10％的患者出現(xiàn)早期出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。尋找與甲狀腺乳頭狀癌生物學(xué)行為相關(guān)的分子標(biāo)記物，對甲狀腺乳頭狀癌病例進(jìn)行分層管理，篩選出預(yù)后不良的高危患者，對指導(dǎo)甲狀腺乳頭狀癌的治療及預(yù)后判斷具有重要意義。
　　甲狀腺乳頭狀癌的臨床特點(diǎn)之一是常多灶發(fā)生，研究甲狀腺乳頭狀癌多發(fā)病灶的克隆起源不僅有助于闡明甲狀腺

2、乳頭狀癌發(fā)病機(jī)制、判定預(yù)后，還有助于為患者選擇合理的治療方式。
　　目的:
　　1.尋找與甲狀腺乳頭狀癌病理診斷和預(yù)后相關(guān)的標(biāo)記物，為甲狀腺乳頭狀癌病理診斷和預(yù)后判斷提供參考依據(jù)。
　　2.研究甲狀腺乳頭狀癌BRAF基因V600E突變與蛋白表達(dá)的相關(guān)性，探討檢測BRAF基因V600E突變蛋白預(yù)測BRAF基因V600E突變的可能性。
　　3.研究甲狀腺乳頭狀癌多發(fā)病灶的克隆起源，為闡明甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病機(jī)制和選擇合

3、理的治療方式提供參考依據(jù)。
　　方法:
　　1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)（MaxVision法）對66例人甲狀腺乳頭狀癌及25例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)，CK19、E-cadherin、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)和ki67進(jìn)行檢測，探討它們在甲狀腺良惡性病變中的表達(dá)差異。并分析ER、PR、CK19、E-cadh

4、erin、CyclinD1和ki67與甲狀腺乳頭狀癌性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病灶大小、TNM分期等的關(guān)系。
　　2.應(yīng)用PCR-熒光探針法及免疫組織化學(xué)方法檢測40例甲狀腺乳頭狀癌組織中BFAFV600E基因突變及蛋白表達(dá)情況，分析BRAFV600E突變及蛋白表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。并分析甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E突變蛋白表達(dá)量與基因拷貝數(shù)的關(guān)系。
　　3.應(yīng)用X染色體失活方法檢測89例女性甲狀腺乳頭狀

5、癌多發(fā)病灶克隆起源。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0，采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為有顯著性差異。
　　結(jié)果:
　　1.本組66例甲狀腺乳頭狀癌中ERa表達(dá)陽性率56.1％，而25例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中陽性率16％，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=11.755，P＜0.05);在甲狀腺乳頭狀癌中，ERa陽性細(xì)胞比例為5％75％，陽性評分37分，均高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的ERa陽性細(xì)胞比例（2％-10％）和陽性評分（4分）

6、。
　　2.甲狀腺乳頭狀癌中PR陽性率(54.5％)顯著高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的陽性率(16％)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=6.722，P＜0.05)。甲狀腺乳頭狀癌PR表達(dá)強(qiáng)度（陽性評分3-8分）高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（陽性評分4-6分）。
　　3.CK19在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)率為98.5％，明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的陽性表達(dá)率(64％)，P＜0.05;且CK19在甲狀腺乳頭狀癌中陽性表達(dá)分值多為8分，即＞60％的腫瘤細(xì)胞呈

7、彌漫強(qiáng)陽性，而結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中陽性分值多為5分，即＞10％-1/3細(xì)胞陽性表達(dá)，其中2例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫70％的癌細(xì)胞CK19呈弱至中等強(qiáng)度表達(dá)。
　　4.甲狀腺乳頭狀癌E-cadherin陽性表達(dá)率為88.3％，而結(jié)節(jié)性甲狀腺腫E-cadherin表達(dá)陽性率為100％，兩者比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(x2=4.740，P＜0.05)。
　　5.CyclinD1在甲狀腺乳頭狀癌中陽性表達(dá)率為97％明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的陽性率(64％

8、)，P＜0.05;兩者在表達(dá)強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差異，均為以50％-75％細(xì)胞中等強(qiáng)度表達(dá)為主。
　　6.ER+PR、ER+CK19、ER+CyclinD1、ER+PR+CK19、ER+PR+CyclinD1，以及PR+CK19+CyclinD1同時(shí)陽性表達(dá)，在甲狀腺乳頭狀癌中的陽性率分別為30.0％、52.5％、45.5％、30.30％、31.82％、45.45％，在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中陽性率分別為4.0％、8.0％、4.0％、4

9、.0％、0％、8％，兩者差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　7.女性38例甲狀腺乳頭狀癌中，病灶＞1cm組ER表達(dá)陽性率為82.4％，病灶≤1cm組ER表達(dá)陽性率為33.3％，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=12.046，P＜0.05);男性28例甲狀腺乳頭狀癌中，病灶≤1cm組ER表達(dá)陽性率為91.7％，病灶＞1cm組ER表達(dá)陽性率為25％，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=12.253，P＜0.05)。
　　8.女性甲狀腺乳頭狀癌PR

10、陽性率(57.9％)顯著高于男性甲狀腺乳頭狀癌PR陽性率(28.6％)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=5.591，P＜0.05)。
　　9.女性甲狀腺乳頭狀癌E-cadherin陽性率(94.7％)顯著高于男性甲狀腺乳頭狀癌E-cadherin陽性率(67.9％)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=8.386，P＜0.05)。
　　10.男性甲狀腺乳頭狀癌Ki67陽性率(10.7％)顯著高于女性甲狀腺乳頭狀癌Ki67陽性率(0％

11、)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.265，P＜0.05。男性年齡＞45歲組Ki67陽性率(30.0％)顯著高于≤45歲年齡組(0％)，兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=6.048，P＜0.05)。
　　11.應(yīng)用PCR-熒光探針法檢測BRAFV600E突變率為85％（34/40例）。應(yīng)用免疫組化方法檢測BRAFV600E蛋白表達(dá)陽性率為90％(36/40例)。BRAFV600E(VE1)抗體靈敏度為100％，特異度為66.67％。

12、
　　12.應(yīng)用PCR-熒光探針法檢測40例甲狀腺乳頭狀癌組織BRAFV600E突變率，在≤45歲組與＞45歲組，男性與女性，病灶≤1cm與病灶＞1cm，有和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組之間進(jìn)行比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　13.當(dāng)以BRAFV600E突變蛋白免疫組化評分3+判定為陽性時(shí)，＞45歲甲狀腺乳頭狀癌組中BRAFV600E蛋白表達(dá)陽性率(50％)高于≤45組(36.63％)，兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組BRAFV600E蛋

13、白表達(dá)陽性率(50％)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(38.36％)，兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　14.BRAFV600E突變免疫組化評分1+病例PCR-熒光探針法檢測BRAFV600E突變的平均△Ct值(4.72)明顯高于免疫組化評分≥2+病例的平均△Ct值(2.85)。
　　15.提取89例女性甲狀腺乳頭狀癌多發(fā)病灶的癌旁正常組織，提取基因組DNA后擴(kuò)增人雄激素受體基因，結(jié)果出現(xiàn)兩條帶的有11例，人雄激素受體基因的雜合率為12.4％

14、(11/89)。11例中甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶HhaI消化后出現(xiàn)兩條帶的有6例。
　　16.在6例14個(gè)不同癌灶中，克隆起源相同者3例，占50％(3/6)，克隆起源不同者2例，占33.3％(2/6)，其中病例5左側(cè)甲狀腺2個(gè)癌灶克隆起源不相同，右側(cè)甲狀腺1個(gè)癌灶與左側(cè)甲狀腺中的1個(gè)癌灶為同一克隆起源。
　　結(jié)論:
　　1.ERa、PR、CK19、CyclinD1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度顯著高于結(jié)節(jié)性甲

15、狀腺腫;提示ERa＞10％的細(xì)胞中等強(qiáng)度陽性、PR＞25％細(xì)胞中等強(qiáng)度陽性、CK19和CyclinD1彌漫（或＞80％）中等強(qiáng)度陽性是甲狀腺乳頭狀癌病理診斷和鑒別診斷中有意義的輔助診斷指標(biāo)。
　　2.ER+PR+CyclinD1或+CK19蛋白同時(shí)陽性表達(dá)是甲狀腺乳頭狀癌診斷和鑒別診斷重要的參考指標(biāo)。
　　3.E-cadherin陰性同時(shí)CK19或CyclinD1陽性是診斷甲狀腺乳頭狀癌較為特異的輔助診斷指標(biāo)。
　　4

16、.ER蛋白表達(dá)陽性率與甲狀腺乳頭狀癌的病灶大小有關(guān);在女性組中，病灶＞1cm者ER陽性率高于病灶≤1cm組;在男性組中，病灶＞1cm者ER陽性率低于病灶≤1cm組ER陽性率;提示在女性甲狀腺乳頭狀癌中雌激素/ER可能起著促使細(xì)胞增殖的作用，是預(yù)后不良的因素之一，而在男性甲狀腺乳頭狀癌中雌激素/ER所起的作用可能和女性甲狀腺乳頭狀癌不同。
　　5.PR蛋白表達(dá)陽性率與甲狀腺乳頭狀癌性別有關(guān)，女性甲狀腺乳頭狀癌PR陽性率高于男性甲狀腺

17、乳頭狀癌;提示PR高表達(dá)可能是女性甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后較男性甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后好的分子機(jī)制之一。
　　6.男性、年齡＞45歲、以及Ki67陽性是甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后不良的因素。
　　7.PCR-熒光探針法和免疫組織化學(xué)方法均可作為甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E突變的檢測方法。應(yīng)用免疫組化BRAFV600E(VE1)抗體檢測甲狀腺乳頭狀癌組織中BRAFV600E突變具有較高的敏感性和特異性。
　　8.應(yīng)用免疫組化BRAFV