A2AR敲除對(duì)小鼠腦缺血再灌注SVZ區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響.pdf

1、目的:1、研究觀(guān)察小鼠局灶性腦缺血再灌注后SVZ區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)及數(shù)目的變化。
　　 2、探討A2AR基因敲除對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注后SVZ區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響。
　　 方法:采用大腦中動(dòng)脈栓塞法復(fù)制腦缺血再灌注模型，將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組（S組），模型組(M)，其中模型組根據(jù)基因型分為A2AR基因敲除模型組(MKO)和A2AR基因野生模型組(MWT)，MKO組和MWT組根據(jù)再

2、灌注時(shí)間分別分為1d組、3d組、7d組，假手術(shù)組分為A2AR基因敲除假手術(shù)組(SKO)和A2AR基因野生假手術(shù)組(SWT)共8組。對(duì)每只小鼠行為學(xué)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，每組隨機(jī)抽取1只小鼠觀(guān)察至規(guī)定時(shí)間經(jīng)心臟灌注固定后取腦組織做成切片，用TTC染色觀(guān)察腦缺血梗死灶;取剩下6只小鼠觀(guān)察至規(guī)定時(shí)間經(jīng)心臟灌注固定后做冰凍切片，用HE染色和尼氏染色液染色觀(guān)察腦組織大體形態(tài)，以及用免疫熒光法觀(guān)察SVZ區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物GFAF表達(dá)和小膠質(zhì)

3、細(xì)胞特異性標(biāo)記物Ibal的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分:
　　 MKO組和MWT組在7d時(shí)與同基因型組內(nèi)1d、3d比較評(píng)分明顯降低，差異有意義(P＜0.05);但是敲除型在3d時(shí)同組內(nèi)與1d相比即有評(píng)分降低，差異有意義(P＜0.05);而野生型同組內(nèi)3d組同1d組比較則差異無(wú)意義。余各組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。S組評(píng)分均為0分，即無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀。
　　 2、腦組織切片TTC染色:
　　

4、假手術(shù)組腦片均紅染，未見(jiàn)白色梗死灶形成;M組均可見(jiàn)白色梗死灶，主要分布于大腦中動(dòng)脈供血部位，如尾殼核和額顳頂葉皮層;MKO7d組和MWT7d組與同基因型組內(nèi)1d組、3d組相比較可見(jiàn)梗死灶有不同程度的減小，顏色減淡。
　　 3、光鏡下腦組織病理學(xué)改變:
　　 3.1.HE染色
　　 假手術(shù)組腦組織無(wú)水腫、壞死，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，邊界清楚，形態(tài)正常;模型組缺血半暗區(qū)（梗死灶周?chē)┚梢?jiàn)細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞腫脹，部分細(xì)

5、胞核固縮、深染或溶解，神經(jīng)細(xì)胞及血管周?chē)g隙擴(kuò)大，組織有大量篩狀空洞，梗死灶中心大量細(xì)胞壞死，組織溶解后留下空洞。
　　 3.2.Nissl染色
　　 假手術(shù)組腦組織染色未見(jiàn)病理改變，模型組梗死灶及其缺血半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，突觸消失，尼氏小體多已溶解，排列疏松。
　　 4、GFAP免疫熒光結(jié)果:
　　 M組野生組均有星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體肥大，突觸增多、增粗、伸長(zhǎng)并且數(shù)目增加，而SKO組和SWT組星形膠質(zhì)細(xì)

6、胞形態(tài)無(wú)變化，S組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯低于M組，各M組對(duì)比S組P值均有意義。MKO組和MWT組小鼠在腦缺血再灌注1后SVZ區(qū)可見(jiàn)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增多，7天后顯著增加;兩基因型對(duì)比，在1d、3d時(shí)對(duì)比無(wú)差異，而7d時(shí)對(duì)比有顯著差異(P＜0.01)。
　　 5、Ibal免疫熒光結(jié)果:
　　 S組小鼠無(wú)論野生型或者敲除型SVZ區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞絕大多數(shù)均處于靜止期，胞體較小，存在分支，突觸較長(zhǎng)且細(xì)，數(shù)目及分布無(wú)異常;M組觀(guān)察

7、到小膠質(zhì)細(xì)胞呈阿米巴樣改變，胞體增大呈橢圓形，突觸增粗但減短，分支減少，熒光著色有所增強(qiáng)，數(shù)目增多;Ibal免疫熒光計(jì)數(shù)顯示，局灶性腦缺血再灌注后MKO組和MWT組均有Ibal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多，均在3d時(shí)達(dá)到高峰;且兩種基因型總體對(duì)比無(wú)差異，但各個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)對(duì)比時(shí)，1d時(shí)無(wú)差異，3d和7d均有差異(P＜0.05)。
　　 6、直線(xiàn)相關(guān)性分析:
　　 MKO組與MWT組的小鼠腦缺血再灌注后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和SVZ區(qū)

8、GFAP免疫熒光計(jì)數(shù)成顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.621，P＜0.01)，余變量間無(wú)相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)論:
　　 1、動(dòng)物的神經(jīng)行為學(xué)、腦組織TTC染色及組織病理學(xué)三方面，表明成功制作了小鼠局灶性腦缺血再灌注模型成功模型。
　　 2、腦缺血再灌注后小鼠SVZ區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均有不同程度激活。
　　 3、A2AR受體敲除對(duì)腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活有一定的抑制作用，有利于控制小鼠腦