新型HIV-1融合抑制劑的研究與基于多肽六股螺旋的人工模擬酶研究.pdf

1、本論文包含兩部分內容,第一部分為“新型HIV-1融合抑制劑的研究”,第二部分為“基于多肽六股螺旋的人工模擬酶研究”。
　　一、新型HIV-1融合抑制劑的研究
　　融合抑制劑是繼逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑成功上市之后的第三類抗HIV藥物。主要針對病毒入侵靶細胞的融合環(huán)節(jié)。相比于前二類抗HIV藥物,融合抑制劑在病毒侵入靶細胞前發(fā)揮作用,在感染的初始環(huán)節(jié)切斷HIV-1的傳播。其中多肽類融合抑制劑T-20已于2003年上市。目前,

2、T-20在臨床上的問題主要是耐藥性,生物利用度低,價格昂貴等。因此,如何解決臨床耐藥性成為研究融合抑制劑(主要是C肽抑制劑)的重點,迫切需要尋找新的抗HIV靶點。
　　為提高抑制劑與靶標的親和力,多價藥物是一個很好的策略。多價抑制劑,它是一種高效的設計策略,通過影響配體與靶標的結合焓變和熵變來達到減小配體-靶標解離常數(shù)的目的,綜合考慮二者的影響,優(yōu)化多價藥物分子結構,從而提高其活性。已有多篇文獻報道了,以藥物多價化為思路,大幅提高

3、活性的成功案例。
　　在本文中,我們針對HIV-1gp41N末端重復序列為分子靶標設計融合抑制劑。以C肽為模板,通過共價交聯(lián),形成類似發(fā)夾結構的相互平行的兩條肽鏈,藉此研究二價C肽分子不同連接位點與不同連接臂對抗HIV融合活性的影響。我們在活性多肽序列的末端引入半胱氨酸,而半胱氨酸與活性序列之間是通過連接臂相連。正是基于這樣一個設計,我們只需制備一條多肽,經(jīng)過氧化即可得到二價分子。二價分子之間通過,末端半胱氨酸巰基相連。這樣的制備

4、方法高效,高產(chǎn)率,清潔。我們主要設計了2大類二價抑制劑,以T-20或C34系列為模板長肽系列,和以C29,C22與SC22EK系列為模板的短肽系列。T-20或C34系列是目前研究較多的肽序列,從這兩條序列展開研究,便于尋找二價抑制劑的規(guī)律。所有肽序列分別設計了N末端或者C末端交聯(lián)的二價分子,以尋找活性最佳化合物。短肽相比長肽,在生物利用度和合成成本上具有優(yōu)勢,因此,針對短肽的二價分子比長肽更加具有應用意義。
　　多肽的合成采用標準

5、的Fmoc固相合成法,多肽的純化采用制備液相進行純化,多肽結構采用MALDI-TOF進行鑒定,純度采用HPLC測定,所有化合物純度均大于94％。一共合成了41個化合物,其中C34與T-20系列20個,C29系列13個,C22系列一共合成了5個化合物,SC22EK系列一共3個。通過細胞-細胞融合實驗評價抗HIV-1活性。
　　在研究中,我們考察了交聯(lián)位點,連接臂以及活性肽序列對協(xié)同效應的影響。由C34或T-20的N末端偶聯(lián)形成的二價

6、分子,以及C末端偶聯(lián)形成的二價分子均具有協(xié)同效應。但是,C34與T-20系列二價化合物協(xié)同效應明顯,但其絕對活性仍然未超過模板序列。這可能是由于一維序列設計所造成的。而C29系列化合物,僅在N末端能夠發(fā)生協(xié)同效應。C22系列化合物由于其本身親和力過低,N末端與C末端均未觀察到協(xié)同效應的出現(xiàn)。
　　連接臂對二價協(xié)同效應的影響較為明顯。其中,在C34的N末端引入β-丙氨酸作為連接臂,能夠最大程度提高活性。β-丙氨酸作為連接臂的二價分子

7、,活性提高最大。由單價分子CβA-C34,經(jīng)過氧化形成二硫鍵連接的二價分子(CβA-C34)2,其結構為(Cys-CONH-CH2CH2CO-C34)2,融合活性從43.7nM提高到了6.4nM,顯示二價抑制劑中兩條C肽鏈間出現(xiàn)了具有良好的協(xié)同效應。
　　活性序列的選擇對二價協(xié)同效應尤為重要。多價抑制劑的設計需滿足一定的條件。C34與T-20系列化合物,其絕對活性仍然未超過模板序列,可能是由于與靶標結合的遷移率造成的。為此,我們進

8、一步縮短肽序列,將肽序列縮短為29個氨基酸的C29。以C29為模板的二價抑制劑出現(xiàn)了非常明顯的活性提升。其中,單價分子CAca-C29[Cys-NH(CH2CH2O)4CO-C29],經(jīng)過氧化形成二硫鍵連接的二價分子(CAca-C29)2[(Cys-NH(CH2CH2O)4CO-C29)2],融合活性也從49.02nM提高到了5.71nM,兩條C肽鏈間體現(xiàn)出了的協(xié)同效果(遠大于模板序列C29融合活性118nM)。此外,我們設計的C29系

9、列二價化學其絕對活性也達到了與C34相當?shù)幕钚运?。C29系列化合物,交聯(lián)成二價抑制劑,相對模板序列C29,其活性提高了2.4~35倍(C29-AcaC除外)。其中活性提高最大的(CTegβA-C29)2,其結構為(Cys-CONH(CH2CH2O)4-CONH-CH2CH2CO-C29)2,融合活性提高到了3.08nM,活性已經(jīng)與高活性序列C34和T-20相當,具有臨床意義。我們又進一步在C末端截短肽序列,發(fā)現(xiàn)難以提升活性,其原因可能

10、是由于C22的親和不夠,難以發(fā)生協(xié)同效應。我們在C22序列中設計基礎上引入Glu-Lys,來替身其螺旋性,改造后的CAca-SC22EK[Cys-NH(CH2CH2O)4CO-SC22EK]出現(xiàn)了非常明顯的活性提高。其活性從38.6nM提高到了4.9nM。
　　HIV-1二價融合抑制劑的設計給我們設計高效的HIV融合抑制劑提供了一些思路,值得進一步研究。二價化的短肽抑制劑,融合活性高,達到了與長肽C34,T-20相當?shù)乃?。而?

11、短肽相比長肽,在生物利用度和合成成本上具有明顯優(yōu)勢。
　　二、基于多肽六股螺旋的人工模擬酶研究
　　天然酶在極端的化學條件或者物理條件下會由于其失去高級結構而失去催化活性。在本文中,我們設計通過分子間共價鍵來穩(wěn)定多肽鏈間三級的策略,以穩(wěn)定在極端的化學條件或者物理條件下的高級結構,使其仍然保持高效的催化活性。
　　我們構建一個共價鍵穩(wěn)定的多肽六股螺旋,在其上引入相互協(xié)同的組氨酸作為功能基進行人工模擬酶研究。該六股螺旋來源

12、于HIV-1gp41的核心結構。一共設計了單共價鍵交聯(lián)的六股螺旋(6HB-1)組,2個共價鍵交聯(lián)的六股螺旋(6HB-2)以及2個交聯(lián)組相對應的未交聯(lián)對照組,共計4組6HB的實驗。
　　實驗用多肽的合成采用Fmoc固相合成法,多肽的純化采用制備液相進行純化,多肽結構采用MALDI-TOF進行鑒定,純度采用HPLC測定,所有化合物純度均大于97%。螺旋間的共價鍵引入,是通過C肽與N肽之間的?；D移反應來發(fā)生。
　　單共價鍵交聯(lián)的

13、六股螺旋(6HB-1)和含有2個共價鍵交聯(lián)的六股螺旋(6HB-2)分別在高溫,高鹽濃度和高表面活性劑條件下測試其催化能力和測定高級結構含量。分別評價高溫,氫鍵作用,疏水作用對共價鍵穩(wěn)定6HB的影響。
　　首先,合成交聯(lián)實驗發(fā)現(xiàn),共價鍵的引入完全不影響螺旋的組裝。
　　其次,在活性測試中,共價鍵的穩(wěn)定體現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢。從飽和動力學的結果可以看出,共價鍵的引入,完全不影響酶系統(tǒng)的催化特征,像天然酶一樣仍然具有飽和動力學特征。在

14、高溫的條件下,雙共價鍵穩(wěn)定的6HB結構更加的穩(wěn)定。在50℃以上,共價鍵穩(wěn)定的6HB其催化能力明顯優(yōu)于對照組(不含共價鍵的6HB)。從絕對活性上來看,在80℃的條件下,雙共價鍵交聯(lián)組仍然保持著較高的催化活性。4M的脲,幾乎完全使得未交聯(lián)的6HB失去螺旋。而6HB-2即使是在8M脲下幾乎仍然保持了100%的螺旋比例。而雙共價鍵穩(wěn)定的6HB-2則8M脲條件下仍然保持了57%水解能力。在1%的Brij35濃度下,6HB-1和6HB-2保留了~5