新型HIV-1融合抑制劑的研究與基于多肽六股螺旋的人工模擬酶研究.pdf

1、本論文包含兩部分內(nèi)容,第一部分為“新型HIV-1融合抑制劑的研究”,第二部分為“基于多肽六股螺旋的人工模擬酶研究”。
　　一、新型HIV-1融合抑制劑的研究
　　融合抑制劑是繼逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑成功上市之后的第三類抗HIV藥物。主要針對病毒入侵靶細(xì)胞的融合環(huán)節(jié)。相比于前二類抗HIV藥物,融合抑制劑在病毒侵入靶細(xì)胞前發(fā)揮作用,在感染的初始環(huán)節(jié)切斷HIV-1的傳播。其中多肽類融合抑制劑T-20已于2003年上市。目前,

2、T-20在臨床上的問題主要是耐藥性,生物利用度低,價格昂貴等。因此,如何解決臨床耐藥性成為研究融合抑制劑(主要是C肽抑制劑)的重點,迫切需要尋找新的抗HIV靶點。
　　為提高抑制劑與靶標(biāo)的親和力,多價藥物是一個很好的策略。多價抑制劑,它是一種高效的設(shè)計策略,通過影響配體與靶標(biāo)的結(jié)合焓變和熵變來達(dá)到減小配體-靶標(biāo)解離常數(shù)的目的,綜合考慮二者的影響,優(yōu)化多價藥物分子結(jié)構(gòu),從而提高其活性。已有多篇文獻(xiàn)報道了,以藥物多價化為思路,大幅提高

3、活性的成功案例。
　　在本文中,我們針對HIV-1gp41N末端重復(fù)序列為分子靶標(biāo)設(shè)計融合抑制劑。以C肽為模板,通過共價交聯(lián),形成類似發(fā)夾結(jié)構(gòu)的相互平行的兩條肽鏈,藉此研究二價C肽分子不同連接位點與不同連接臂對抗HIV融合活性的影響。我們在活性多肽序列的末端引入半胱氨酸,而半胱氨酸與活性序列之間是通過連接臂相連。正是基于這樣一個設(shè)計,我們只需制備一條多肽,經(jīng)過氧化即可得到二價分子。二價分子之間通過,末端半胱氨酸巰基相連。這樣的制備

4、方法高效,高產(chǎn)率,清潔。我們主要設(shè)計了2大類二價抑制劑,以T-20或C34系列為模板長肽系列,和以C29,C22與SC22EK系列為模板的短肽系列。T-20或C34系列是目前研究較多的肽序列,從這兩條序列展開研究,便于尋找二價抑制劑的規(guī)律。所有肽序列分別設(shè)計了N末端或者C末端交聯(lián)的二價分子,以尋找活性最佳化合物。短肽相比長肽,在生物利用度和合成成本上具有優(yōu)勢,因此,針對短肽的二價分子比長肽更加具有應(yīng)用意義。
　　多肽的合成采用標(biāo)準(zhǔn)

5、的Fmoc固相合成法,多肽的純化采用制備液相進(jìn)行純化,多肽結(jié)構(gòu)采用MALDI-TOF進(jìn)行鑒定,純度采用HPLC測定,所有化合物純度均大于94％。一共合成了41個化合物,其中C34與T-20系列20個,C29系列13個,C22系列一共合成了5個化合物,SC22EK系列一共3個。通過細(xì)胞-細(xì)胞融合實驗評價抗HIV-1活性。
　　在研究中,我們考察了交聯(lián)位點,連接臂以及活性肽序列對協(xié)同效應(yīng)的影響。由C34或T-20的N末端偶聯(lián)形成的二價

6、分子,以及C末端偶聯(lián)形成的二價分子均具有協(xié)同效應(yīng)。但是,C34與T-20系列二價化合物協(xié)同效應(yīng)明顯,但其絕對活性仍然未超過模板序列。這可能是由于一維序列設(shè)計所造成的。而C29系列化合物,僅在N末端能夠發(fā)生協(xié)同效應(yīng)。C22系列化合物由于其本身親和力過低,N末端與C末端均未觀察到協(xié)同效應(yīng)的出現(xiàn)。
　　連接臂對二價協(xié)同效應(yīng)的影響較為明顯。其中,在C34的N末端引入β-丙氨酸作為連接臂,能夠最大程度提高活性。β-丙氨酸作為連接臂的二價分子

7、,活性提高最大。由單價分子CβA-C34,經(jīng)過氧化形成二硫鍵連接的二價分子(CβA-C34)2,其結(jié)構(gòu)為(Cys-CONH-CH2CH2CO-C34)2,融合活性從43.7nM提高到了6.4nM,顯示二價抑制劑中兩條C肽鏈間出現(xiàn)了具有良好的協(xié)同效應(yīng)。
　　活性序列的選擇對二價協(xié)同效應(yīng)尤為重要。多價抑制劑的設(shè)計需滿足一定的條件。C34與T-20系列化合物,其絕對活性仍然未超過模板序列,可能是由于與靶標(biāo)結(jié)合的遷移率造成的。為此,我們進(jìn)

8、一步縮短肽序列,將肽序列縮短為29個氨基酸的C29。以C29為模板的二價抑制劑出現(xiàn)了非常明顯的活性提升。其中,單價分子CAca-C29[Cys-NH(CH2CH2O)4CO-C29],經(jīng)過氧化形成二硫鍵連接的二價分子(CAca-C29)2[(Cys-NH(CH2CH2O)4CO-C29)2],融合活性也從49.02nM提高到了5.71nM,兩條C肽鏈間體現(xiàn)出了的協(xié)同效果(遠(yuǎn)大于模板序列C29融合活性118nM)。此外,我們設(shè)計的C29系

9、列二價化學(xué)其絕對活性也達(dá)到了與C34相當(dāng)?shù)幕钚运?。C29系列化合物,交聯(lián)成二價抑制劑,相對模板序列C29,其活性提高了2.4~35倍(C29-AcaC除外)。其中活性提高最大的(CTegβA-C29)2,其結(jié)構(gòu)為(Cys-CONH(CH2CH2O)4-CONH-CH2CH2CO-C29)2,融合活性提高到了3.08nM,活性已經(jīng)與高活性序列C34和T-20相當(dāng),具有臨床意義。我們又進(jìn)一步在C末端截短肽序列,發(fā)現(xiàn)難以提升活性,其原因可能

10、是由于C22的親和不夠,難以發(fā)生協(xié)同效應(yīng)。我們在C22序列中設(shè)計基礎(chǔ)上引入Glu-Lys,來替身其螺旋性,改造后的CAca-SC22EK[Cys-NH(CH2CH2O)4CO-SC22EK]出現(xiàn)了非常明顯的活性提高。其活性從38.6nM提高到了4.9nM。
　　HIV-1二價融合抑制劑的設(shè)計給我們設(shè)計高效的HIV融合抑制劑提供了一些思路,值得進(jìn)一步研究。二價化的短肽抑制劑,融合活性高,達(dá)到了與長肽C34,T-20相當(dāng)?shù)乃?。而?

11、短肽相比長肽,在生物利用度和合成成本上具有明顯優(yōu)勢。
　　二、基于多肽六股螺旋的人工模擬酶研究
　　天然酶在極端的化學(xué)條件或者物理條件下會由于其失去高級結(jié)構(gòu)而失去催化活性。在本文中,我們設(shè)計通過分子間共價鍵來穩(wěn)定多肽鏈間三級的策略,以穩(wěn)定在極端的化學(xué)條件或者物理條件下的高級結(jié)構(gòu),使其仍然保持高效的催化活性。
　　我們構(gòu)建一個共價鍵穩(wěn)定的多肽六股螺旋,在其上引入相互協(xié)同的組氨酸作為功能基進(jìn)行人工模擬酶研究。該六股螺旋來源

12、于HIV-1gp41的核心結(jié)構(gòu)。一共設(shè)計了單共價鍵交聯(lián)的六股螺旋(6HB-1)組,2個共價鍵交聯(lián)的六股螺旋(6HB-2)以及2個交聯(lián)組相對應(yīng)的未交聯(lián)對照組,共計4組6HB的實驗。
　　實驗用多肽的合成采用Fmoc固相合成法,多肽的純化采用制備液相進(jìn)行純化,多肽結(jié)構(gòu)采用MALDI-TOF進(jìn)行鑒定,純度采用HPLC測定,所有化合物純度均大于97%。螺旋間的共價鍵引入,是通過C肽與N肽之間的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)來發(fā)生。
　　單共價鍵交聯(lián)的

13、六股螺旋(6HB-1)和含有2個共價鍵交聯(lián)的六股螺旋(6HB-2)分別在高溫,高鹽濃度和高表面活性劑條件下測試其催化能力和測定高級結(jié)構(gòu)含量。分別評價高溫,氫鍵作用,疏水作用對共價鍵穩(wěn)定6HB的影響。
　　首先,合成交聯(lián)實驗發(fā)現(xiàn),共價鍵的引入完全不影響螺旋的組裝。
　　其次,在活性測試中,共價鍵的穩(wěn)定體現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢。從飽和動力學(xué)的結(jié)果可以看出,共價鍵的引入,完全不影響酶系統(tǒng)的催化特征,像天然酶一樣仍然具有飽和動力學(xué)特征。在

14、高溫的條件下,雙共價鍵穩(wěn)定的6HB結(jié)構(gòu)更加的穩(wěn)定。在50℃以上,共價鍵穩(wěn)定的6HB其催化能力明顯優(yōu)于對照組(不含共價鍵的6HB)。從絕對活性上來看,在80℃的條件下,雙共價鍵交聯(lián)組仍然保持著較高的催化活性。4M的脲,幾乎完全使得未交聯(lián)的6HB失去螺旋。而6HB-2即使是在8M脲下幾乎仍然保持了100%的螺旋比例。而雙共價鍵穩(wěn)定的6HB-2則8M脲條件下仍然保持了57%水解能力。在1%的Brij35濃度下,6HB-1和6HB-2保留了~5