不同齲深狀態(tài)下人成牙質(zhì)細胞的凋亡及凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達.pdf

1、目的:細胞凋亡（apoptosis）也稱程序性細胞死亡(programmedcelldeath，PCD)，是指在凋亡信號刺激下，機體為維護其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的細胞主動有序的死亡過程。凋亡發(fā)生在生命個體的生長、發(fā)育、成熟和衰老各個階段，具有非常重要的意義，一直是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。在細胞凋亡的研究過程中，發(fā)現(xiàn)bcl-2家族基因在其中起著重要的作用，典型的有抗凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax。研究表明，bcl-2基因的抗凋亡作

2、用和bax基因的促凋亡作用是通過二者在組織細胞中所表達的蛋白量來完成的，Bcl-2/Bax蛋白比值調(diào)控著細胞凋亡的進程。
　　 牙髓組織和身體其他組織一樣，都存在著細胞凋亡。成牙本質(zhì)細胞(odontoblast)是牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的特征性細胞，它的細胞突起伸入到牙本質(zhì)中，是牙髓內(nèi)最早接觸外來損傷刺激的細胞。許多研究表明，齲病進展到牙本質(zhì)以后，牙髓會出現(xiàn)相應(yīng)的病理改變，包括細胞凋亡和修復(fù)性牙本質(zhì)形成。但不同的報道之間存在較大差異，

3、目前缺乏隨病變進展的動態(tài)及定量研究。
　　 本實驗通過HE染色、TUNEL染色和凋亡蛋白Bcl-2、Bax免疫組織化學(xué)染色對人離體牙標本進行研究，進而探討齲病進展中成牙本質(zhì)細胞的凋亡機制，以及凋亡與成牙本質(zhì)細胞損傷修復(fù)動態(tài)變化的可能關(guān)系。
　　 方法:
　　 1標本選擇與制備:經(jīng)患者知情同意，選牙根發(fā)育完成且可完整拔除，患不同程度齲病但無治療與保留價值的第三磨牙?；颊吣挲g20～40歲，無系統(tǒng)性疾病，牙體已萌出且無

4、充填物、無明顯磨耗和磨損、無牙周病患。拔牙前記錄病史、臨床癥狀、牙髓活力值及X線結(jié)果，且病損均為慢性齲，發(fā)生于(拾)面。參照《牙體牙髓病學(xué)》慢性齲診斷標準和齲病深度分級標準將其分為正常牙組、淺齲組、中齲組和深齲組，每組20顆。拔除后即刻截根，標記病損部位，固定脫鈣，分切沖洗，石蠟包埋，2.5μm切片。
　　 2HE染色:觀察髓頂中部或齲損部位下方有無修復(fù)性牙本質(zhì)形成，計數(shù)成牙本質(zhì)細胞。
　　 3TUNEL染色:觀察成牙本

5、質(zhì)細胞的凋亡情況，計算其凋亡指數(shù)（apoptoticindex，AI）。棕黃色或褐色胞核的細胞為陽性，即凋亡細胞，藍色胞核的細胞為陰性。AI=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100％。
　　 4免疫組織化學(xué)染色:觀察蛋白Bcl-2和Bax在成牙本質(zhì)細胞內(nèi)的表達情況。Moticmedical6.0圖像分析系統(tǒng)定量灰度值。
　　 5SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1HE染色結(jié)果
　　

6、1.1正常牙組:髓頂中部下方牙髓分層清楚，乏細胞層和多細胞層明顯。成牙本質(zhì)細胞高柱狀，胞漿豐富，高倍鏡下成牙本質(zhì)細胞數(shù)量約為15.42個/100μm。未發(fā)現(xiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成。
　　 1.2淺齲組:齲損部位下方牙髓分層清楚，乏細胞層和多細胞層明顯。成牙本質(zhì)細胞高柱狀，胞漿豐富，高倍鏡下成牙本質(zhì)細胞數(shù)量約為15.71個/100μm。未發(fā)現(xiàn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成。
　　 1.3中齲組:大部分齲損部位下方牙髓無明顯分層，乏細胞層消失，

7、有修復(fù)性牙本質(zhì)形成。修復(fù)性牙本質(zhì)下方的成牙本質(zhì)細胞矮柱狀或立方狀，胞漿較少，高倍鏡下成牙本質(zhì)細胞數(shù)量約為9.91個/100μm。其他部位的成牙本質(zhì)細胞類似于正常牙組且無修復(fù)性牙本質(zhì)形成。
　　 1.4深齲組:齲損部位下方牙髓無明顯分層，乏細胞層消失，均有較厚修復(fù)性牙本質(zhì)形成。修復(fù)性牙本質(zhì)下方的成牙本質(zhì)細胞立方狀或扁平狀，胞漿少，高倍鏡下成牙本質(zhì)細胞數(shù)量約為6.41個/100μm。其他部位的成牙本質(zhì)細胞類似于正常牙組且無修復(fù)性牙本

8、質(zhì)形成。
　　 使用SNK法分析，正常牙組和淺齲組之間的成牙本質(zhì)細胞數(shù)無差異，其他各組間比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2TUNEL染色
　　 2.1正常牙組:髓頂中部下方成牙本質(zhì)細胞層的凋亡指數(shù)約為0.20。
　　 2.2淺齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細胞層的凋亡指數(shù)約為0.21。
　　 2.3中齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細胞層的凋亡指數(shù)約為28.65。
　　 2.4深齲組:

9、齲損部位下方成牙本質(zhì)細胞層的凋亡指數(shù)約為52.68。
　　 使用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗進行分析，正常牙組和淺齲組之間無差異，其他各組間比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3免疫組織化學(xué)染色
　　 3.1凋亡蛋白Bcl-2
　　 3.1.1正常牙組:髓頂中部下方成牙本質(zhì)細胞胞核未著色，胞漿淺黃色，灰度值約為198.00。
　　 3.1.2淺齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細胞胞核未著色，胞漿淺黃色

10、，灰度值約為197.93。
　　 3.1.3中齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細胞胞核未著色，胞漿黃色，灰度值約為178.98。
　　 3.1.4深齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細胞胞核未著色，胞漿棕黃色，灰度值約為151.40。
　　 使用SNK法分析，正常牙組和淺齲組之間無差異，其他各組間比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.2凋亡蛋白Bax
　　 3.2.1正常牙組:髓頂中部下方成牙本質(zhì)細

11、胞胞核未著色，胞漿淺黃色，灰度值約為196.23。
　　 3.2.2淺齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細胞胞核未著色，胞漿淺黃色，灰度值約為195.24。
　　 3.2.3中齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細胞胞核未著色，胞漿棕黃色，灰度值約為150.53。
　　 3.2.4深齲組:齲損部位下方成牙本質(zhì)細胞胞核未著色，胞漿棕褐色，灰度值約為117.51。
　　 使用SNK法分析，正常牙組和淺齲組之間無差異，其他各組間

12、比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1齲損局限于釉質(zhì)時，成牙本質(zhì)細胞無明顯凋亡;齲損發(fā)展到牙本質(zhì)以后，成牙本質(zhì)細胞出現(xiàn)明顯的凋亡，凋亡細胞的數(shù)量隨著齲病的進展而逐步增多。對淺齲、中齲和深齲組的凋亡指數(shù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示成牙本質(zhì)細胞凋亡與修復(fù)性牙本質(zhì)的形成可能存在一定關(guān)系。
　　 2正常牙組和淺齲組抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax的表達水平均較低，中齲組和深齲組兩