哮喘小鼠模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激變化及谷氨酰胺的干預(yù)作用機(jī)制.pdf

1、背景與目的：全世界哮喘發(fā)病率逐漸增加，我國(guó)哮喘患者也逐年上升，因此研究哮喘發(fā)病機(jī)制并尋求有效而副作用小的藥物成為研究熱點(diǎn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS)是真核細(xì)胞的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，病毒感染,氧化應(yīng)激、缺血缺氧、營(yíng)養(yǎng)不足和鈣失衡等均可引起ERS，因此ERS參與多種疾病的病理和生理過(guò)程，包括肝功能損傷，神經(jīng)退行性病變，循環(huán)系統(tǒng)疾病，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等。ERS以多種機(jī)制作用于炎癥反應(yīng)通路，與機(jī)體的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，所以ERS也參與了很多炎癥性疾病，

2、呼吸系統(tǒng)疾病中有較多關(guān)于ERS與慢阻肺的關(guān)系報(bào)道，但ERS與哮喘關(guān)系的研究報(bào)道國(guó)內(nèi)甚少，而哮喘本質(zhì)是氣道慢性炎癥，故推測(cè)ERS也參與了哮喘的發(fā)病。哮喘治療目前臨床上主要應(yīng)用激素及支氣管擴(kuò)張藥等，但長(zhǎng)期應(yīng)用可帶來(lái)較多副作用，對(duì)兒童生長(zhǎng)發(fā)育也有一定影響。谷氨酰胺是體內(nèi)非必需氨基酸，主要用做胃粘膜保護(hù)劑治療慢性胃炎，潰瘍等，但也有很多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺有抗炎，調(diào)節(jié)免疫，保護(hù)粘膜屏障等作用，而哮喘發(fā)病與T細(xì)胞免疫功能異常有關(guān)，而且以慢性氣道炎

3、癥為其特點(diǎn)，推測(cè)谷氨酰胺可應(yīng)用于哮喘的治療。本論文主要探討哮喘小鼠模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激變化及炎癥因子的改變，并應(yīng)用谷氨酰胺干預(yù)后觀察了谷氨酰胺對(duì)哮喘的治療作用及其可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.6-8周齡BALB/C小鼠，以卵蛋白及氫氧化鋁致敏后霧化吸入卵蛋白激發(fā)氣道制備哮喘小鼠模型。小鼠隨機(jī)分成5組，每組各10只。A正常對(duì)照組；B哮喘模型組；C低劑量谷氨酰胺治療組:0.4g/kg；D中劑量谷氨酰胺治療組:0.75g/kg

4、；E大劑量谷氨酰胺治療組：1.5g/kg。
　　2.取各組小鼠血清用ELISA法測(cè)定IL-6，IL-4，IgE，TNFα,IL-12水平；
　　3.取各組小鼠BALF離心后的細(xì)胞涂片進(jìn)行Diff-quik染色，檢測(cè)白細(xì)胞數(shù)及嗜酸細(xì)胞數(shù)；
　　4.取各組小鼠BALF上清液用ELISA法測(cè)定IL-6，IL-4。
　　5.小鼠一側(cè)肺組織甲醛固定后進(jìn)行HE染色觀察肺部炎癥改變。
　　6.另一側(cè)肺用 Western

5、Blot方法檢測(cè)肺組織 JNK,pJNK,CHOP,GRP78，IRE-1,BAX,Bcl2,Caspase12表達(dá)。
　　7.利用衣霉素制備細(xì)胞ERS模型：體外培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)不同濃度（0.1ug/ml，1ug／ml，10ug/ml）衣霉素對(duì)A549細(xì)胞作用不同時(shí)間（6,12,24,48h)的細(xì)胞增值抑制率，選定應(yīng)用衣霉素合適濃度及時(shí)間。
　　8.MTT法檢測(cè)不同濃度谷氨酰胺（2，4，8，12

6、，16mmol/l）對(duì)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的A549細(xì)胞的作用不同時(shí)間點(diǎn)（12,24,48小時(shí)）的細(xì)胞增殖抑制率，選定應(yīng)用谷氨酰胺的合適濃度及時(shí)間。
　　9.細(xì)胞培養(yǎng)分5組，空白對(duì)照組：在培養(yǎng)液中只有A549細(xì)胞及；衣霉素組：培養(yǎng)液中加入A549細(xì)胞及衣霉素1ug／ml;不同濃度谷氨酰胺組，分3組：GLN4組：培養(yǎng)液中加入A549細(xì)胞，衣霉素1ug／ml以及4mmol/l谷氨酰胺；GLN8組：培養(yǎng)液中加入A549細(xì)胞，衣霉素1ug／

7、ml及8mmol/l谷氨酰胺；GLN12組：培養(yǎng)液中加入A549細(xì)胞，衣霉素1ug／ml及12mmol/l谷氨酰胺。Western Blot方法檢測(cè)不同細(xì)胞組培養(yǎng)12小時(shí)后的JNK,pJNK.CHOP,GPR78表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.B組（模型組）血清IL-6，IL-4，IgE，TNFα水平較A組（對(duì)照組）明顯升高，IL-12水平明顯降低，差異有顯著性。C,D,E,組血清IL-6，IL-4，IgE,TNFα較B組明

8、顯降低，IL-12水平明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.Diff-quik染色結(jié)果：B組（模型組）肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)及嗜酸細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于A組（正常組）差異有顯著性；C,D,E組肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)及嗜酸細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少，但高于正常組，差異有顯著性。
　　3.B組（模型組）肺泡灌洗液中IL-6，IL-4水平較A組（對(duì)照組）明顯升高，差異有顯著性。C,D,E組肺泡灌洗液中IL-6，IL-4較B組明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

9、
　　4.肺組織病理結(jié)果：HE染色結(jié)果,B組與A組比較，支氣管及血管周圍大量淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；支氣管上皮細(xì)胞多處脫落，基底膜可見(jiàn)輕度增厚，支氣管平滑肌有增生表現(xiàn)，細(xì)小的支氣管內(nèi)可見(jiàn)到較多粘液栓和炎性滲出物，肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)也可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；C.D.E組較模型組比較，支氣管及血管周圍，肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，支氣管上皮脫落減少，肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞減少。
　　5.B組與A組比較，小鼠肺組織pJNK.CHO

10、P,GPR78,IRE1表達(dá)水平明顯升高，而JNK表達(dá)無(wú)明顯差異，說(shuō)明哮喘發(fā)病時(shí)肺部發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。谷氨酰胺治療組的pJNK.CHOP,GPR78,IRE1表達(dá)水平較模型組明顯降低，差異有顯著性，說(shuō)明谷氨酰胺對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有保護(hù)作用;B組與A組比較，小鼠肺組織BAX/Bcl2,Caspase12表達(dá)水平明顯升高,谷氨酰胺治療組其值降低，說(shuō)明谷氨酰胺通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　6.細(xì)胞毒性MTT方法檢測(cè)結(jié)果

11、，衣霉素處理細(xì)胞A549濃度為1ug/ml，作用時(shí)間為12小時(shí)時(shí)細(xì)胞增值抑制率為51.3％,最接近50%，故選擇衣霉素作用濃度為1ug/ml，作用時(shí)間為12h。
　　7. MTT法檢測(cè)不同濃度谷氨酰胺（2,4,8,12,16mmol/l）對(duì)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的A549細(xì)胞作用不同時(shí)間點(diǎn)（12,24,48小時(shí)）的細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果為谷氨酰胺8mmol/l作用12小時(shí)的細(xì)胞增殖抑制率為48.9%，最接近50%，故選擇此濃度及時(shí)間點(diǎn)為合

12、適作用濃度及時(shí)間。
　　8.體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中，衣霉素組較空白對(duì)照組pJNK.CHOP,GPR78表達(dá)水平明顯升高，而JNK表達(dá)無(wú)明顯差異，說(shuō)明衣霉素誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。谷氨酰胺+衣霉素組的pJNK.CHOP,GPR78表達(dá)水平較衣霉素組明顯降低，差異有顯著性，說(shuō)明谷氨酰胺對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有保護(hù)作用。
　　結(jié)論：
　　1.哮喘時(shí)有IL-4，IL-6，IgE，TNFα這些促炎癥因子水平增高，血清抑炎因子IL-1