aFGF基因轉(zhuǎn)染MSCs預(yù)防運動終板退變及肌萎縮研究.pdf

1、[研究背景]
　　 大量研究發(fā)現(xiàn)肌細胞正常結(jié)構(gòu)與功能維持需要靠一些神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用。運動神經(jīng)損傷后，骨骼肌失神經(jīng)支配最大變化便是這種神經(jīng)營養(yǎng)因子丟失，同時骨骼肌廢用性萎縮，最終導(dǎo)致肌肉形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化等方面改變，組織形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為運動終板退變、肌細胞漿丟失、直徑減小，并隨時間延長而逐漸加重。目前關(guān)于運動神經(jīng)損傷后功能重建主要還是集中在恢復(fù)神經(jīng)連續(xù)性上，忽視了對其靶器官的保護，由于神經(jīng)漫長的再生過程、再生過程中神經(jīng)出現(xiàn)再退變、

2、損傷部位阻擋因素、修復(fù)后肢體固定等原因，即使及時修復(fù)神經(jīng)，肌肉失神經(jīng)支配時間仍然很長，神經(jīng)對肌肉的營養(yǎng)作用喪失，運動終板逐漸退變，給神經(jīng)肌肉接頭重建帶來極大的困難。臨床常見肌肉呈念珠狀變性、橫紋消失，肌肉萎縮，時間過長肌肉壞死、消失，而且肌肉失用、萎縮亦會影響運動終板的形態(tài)，二者之間形成惡性循環(huán)，成為目前嚴(yán)重阻礙運動神經(jīng)修復(fù)后功能恢復(fù)的最重要因素之一，由此導(dǎo)致的肢體傷殘嚴(yán)重損害患者的身心健康及勞動能力，給個人、家庭、社會帶來沉重的負擔(dān)。

3、因此，致力于精確修復(fù)神經(jīng)、促進神經(jīng)生長同時應(yīng)采取有效措施預(yù)防運動終板退變及肌萎縮已成為共識，如何預(yù)防失神經(jīng)支配運動終板退變及肌萎縮已成為當(dāng)前運動神經(jīng)損傷后功能重建過程中急需解決的難題。
　　 近年來為了防止或延緩失神經(jīng)支配后運動終板退變及肌萎縮，提高周圍神經(jīng)損傷的療效，國內(nèi)外學(xué)者從多個角度對其開展了研究，創(chuàng)造出一系列方法，包括:①被動鍛煉;②神經(jīng)纖維、神經(jīng)元肌肉內(nèi)植入;③脈沖式磁療、電刺激;④藥物:各種神經(jīng)生長因子、激素等。被動

4、鍛煉是臨床上最常用的方法，有研究證實，采取被動活動能促使癱瘓肌肉被動性縮短和拉長，這樣做一方面促進了肌肉血液循環(huán)，減輕組織水腫，縮短了血液中氧和營養(yǎng)物質(zhì)與肌細胞間的彌散距離，另一方面通過機械性肌纖維拉長與縮短，使肌肉保持一定彈性，防止關(guān)節(jié)僵硬、廢用性骨質(zhì)疏松與肌萎縮，為再生的神經(jīng)纖維到達靶器官做準(zhǔn)備，但臨床上實現(xiàn)常會遇見一些困難，如修復(fù)神經(jīng)早期、骨折早期等常需施行早期固定肢體，加之患者長期被動鍛煉難以持久配合，常造成退變不可避免。脈沖磁

5、療、電刺激預(yù)防終板退變及肌萎縮觀點被越來越多臨床醫(yī)生接受，并把電刺激、磁療逐漸應(yīng)用于臨床[7]。Shimada、Boonyarom等發(fā)現(xiàn)磁療、電刺激可明顯減輕神經(jīng)損傷后肌細胞的凋亡、增加Ⅰ型肌纖維和Ⅱ型肌纖維直徑、減緩肌肉重量的減輕，從而延緩運動終板退變及肌萎縮。但由于設(shè)備難以普及、臨床療效緩慢且不確切等原因，臨床上推廣并不順利。近年在藥物研究方面取得了一些顯著成果:國內(nèi)外研究顯示神經(jīng)斷端間應(yīng)用神經(jīng)生長因子(NGF)或肝細胞生長因子(H

6、GF)可減輕運動終板退變，其作用機理可能通過軸漿運輸與靶器官相應(yīng)受體結(jié)合來實現(xiàn)，然而神經(jīng)斷端間應(yīng)用藥物僅適應(yīng)于Seddon分類Ⅲ度神經(jīng)損傷，對適合于非手術(shù)療法治療者或Seddon分類Ⅰ、Ⅱ度神經(jīng)損傷無法采用，且神經(jīng)斷端間使用緩釋系統(tǒng)難度大，無法保證藥物的長效作用，研究前景暗淡。口服氨哮素可以防止失神經(jīng)支配后運動終板退變、肌肉萎縮，其作用可能是通過某種途徑使MSCs產(chǎn)生一種胰島素樣生長因子(IGF)的營養(yǎng)物質(zhì)模仿神經(jīng)對肌肉的營養(yǎng)作用。有作

7、者報道地塞米松有保護膜性結(jié)構(gòu)的作用，大鼠腹腔注射可以減緩非離斷性損傷神經(jīng)支配運動終板的退變，但地塞米松系激素類藥物，長期應(yīng)用副作用明顯，僅限于實驗研究，不宜長期應(yīng)用于神經(jīng)損傷患者，臨床應(yīng)用前景暗淡。
　　 基因治療是近年來一門新興學(xué)科，它是指將外源基因?qū)氚屑毎⒂行П磉_，通過移植靶細胞達到治療疾病目的?；蛑委煶３Ｐ枰栌酶杉毎麃頂y帶外源基因，MSCs就是常用干細胞之一，它于1961年就被Mauro等[18]首次在蛙骨骼肌中發(fā)

8、現(xiàn)，是一種具有增殖和自我更新能力的成肌前體細胞或肌源性干細胞，在出生后骨骼肌損傷修復(fù)和維持中起著重要的作用。有研究報道:肌肉失神經(jīng)支配后初期MSCs數(shù)量增加，但以后其數(shù)量明顯降低、體積縮小，長期失神經(jīng)支配MSCs增生潛力顯著降低，MSCs數(shù)量逐漸減少，部分研究認為這種進行性降低是由于失神經(jīng)支配狀態(tài)下MSCs發(fā)生了凋亡，因為神經(jīng)的營養(yǎng)作用對維持MSCs含量和功能是非常重要。Viguie等推測其下降的原因為:長期失神經(jīng)支配MSCs凋亡后無再

9、生替代、MSCs合并到萎縮或新生肌纖維中的速度快于其增殖的速度。根據(jù)這一變化，許多學(xué)者認為MSCs數(shù)量的逐漸減少是影響長期失神經(jīng)支配后骨骼肌功能恢復(fù)的一個重要原因。人們通過對骨骼肌再生過程研究發(fā)現(xiàn)，生長因子參與MSCs不同細胞周期的調(diào)節(jié)。利用細胞培養(yǎng)技術(shù)，已經(jīng)檢測出多種生長因子影響MSCs的生長調(diào)節(jié)，它們或者單獨作用，或者多種細胞因子聯(lián)合作用，研究較多的有以下幾種生長因子:體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，IGF（胰島素樣生長因子）-Ⅰ和IGF-Ⅱ可以增加

10、MSCs的增殖和分化，給細胞注射IGF-Ⅰ，可促進MSCs增殖和肌肉數(shù)量的增加;肝細胞生長因子(HGF)對MSCs的調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在多個方面，包括作為一個潛在的趨化因子、MSCs的激活因子和成纖維細胞分化的抑制因子，HGF能激活和有選擇性地促使MSCs增殖;Yablonka-Reuveni等證實FGF可促進幼年鼠及成年鼠MSCs增殖;McFarland等在對MSCs培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)FGF家族對MSCs增殖的詳細作用，在FGF家族9種常見亞型中，

11、FGF-1（即aFGF）、FGF-2、FGF-4、FGF-6和FGF-9被證實可以刺激MSCs增殖，同時HGF和FGF-2、FGF-4、FGF-6或FGF-9的協(xié)同作用，能提高增殖效率。Kastner,Dong等也在不同時期分別報道aFGF能促進MSCs增殖和分裂，本課題組在前期aFGF蛋白緩釋系統(tǒng)保護運動終板及預(yù)防肌萎縮亦觀察到aFGF具有維持MSCs數(shù)量作用。
　　 基于以上理論和實驗基礎(chǔ)，認為MSCs與aFGF二者關(guān)系密切

12、，擬行aFGF基因轉(zhuǎn)染MSCs，然后通過移植來預(yù)防運動終板退變及肌萎縮，目的在于持久有效維持失神經(jīng)支配期間骨骼肌神經(jīng)營養(yǎng)作用，同時穩(wěn)定骨骼肌MSCs數(shù)量，試圖從根本上有效預(yù)防運動終板退變及肌萎縮，從而提高運動神經(jīng)損傷修復(fù)效果。
　　 [目的]
　　 1.探索MSCs分離、純化、培養(yǎng)及鑒定方法。
　　 2.探討aFGF基因轉(zhuǎn)染MSCs方法，檢測其表達情況。
　　 3.研究移植aFGF基因轉(zhuǎn)染的MSCs預(yù)防失

13、神經(jīng)支配運動終板退變及肌萎縮作用。
　　 [方法]
　　 1.MSCs分離、培養(yǎng)及鑒定:取Wister成年大鼠后肢肌肉，兩步酶消化法結(jié)合差速貼壁培養(yǎng)法分離純化MSCs，觀察細胞生長特性并做免疫組織化學(xué)鑒定;2.真核表達載體構(gòu)建:提取人類肌肉組織總RNA，RT-PCR法調(diào)取aFGF基因，然后用無模板自擴增技術(shù)合成人類白細胞介素2信號肽序列(signal peptidesequence，SPS)，通過基因融合得到SPS-aF

14、GF，再通過定向克隆到真核表達載體pEGFP-N1，最終得到重組質(zhì)粒PEGFP-N1-SPS-aFGF，對重組質(zhì)粒做測序和酶切鑒定;
　　 3.體外實驗分組、基因轉(zhuǎn)染及檢測表達情況:經(jīng)鑒定正確的細胞隨機分為3組:目的基因組(aFGF+N1)、空載質(zhì)粒組(N1)、空白對照組(Blank)，前兩組分別加入質(zhì)粒PEGFP-N1-SPS-aFGF與pEGFP-N1質(zhì)粒，空白對照組不加入任何質(zhì)粒，均在脂質(zhì)體Lipofectamine200

15、0TM Reagent介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡統(tǒng)計發(fā)綠色熒光的細胞占各組細胞比例，計算轉(zhuǎn)染效率;轉(zhuǎn)染2天后更換為含有G418的生長培養(yǎng)基進行穩(wěn)定篩選;轉(zhuǎn)染72h后利用實時熒光定量PCR與Western blot檢測aFGF基因在MSCs中表達情況。
　　 4.動物神經(jīng)損傷模型制作及檢測移植細胞療效:40只成年純系Wister大鼠在全麻（10％水合氯醛腹腔注射）下切斷右側(cè)腓總神經(jīng)脛前肌分支(距神經(jīng)入肌點約1.5cm)，縫合神經(jīng)

16、外膜，然后將大鼠隨機分為4組:A組:脛前肌植入(aFGF+N1)組細胞;B組:脛前肌植入(N1)組細胞;C組:脛前肌植入(Blank)組細胞;D組:植入等量生理鹽水。A組為實驗組，B組、C組、D組為對照組，術(shù)后觀察4周，4周后肉眼觀察肌肉的外觀形態(tài)、測量肌肉濕重、氯化金染色觀察運動終板形態(tài)、誘發(fā)電位肌電圖儀進行神經(jīng)低頻重復(fù)電刺激檢測運動終板傳導(dǎo)功能，具體方法為刺激坐骨神經(jīng)，記錄脛前肌肌電波波幅，在脈沖電流刺激頻率為3～5Hz的條件下連續(xù)

17、刺激9次，觀察有無衰減，以第5個肌電波波幅比第一個降低10％以上為陽性，統(tǒng)計各組第五次刺激肌電波波幅衰減率均數(shù)。
　　 [結(jié)果]
　　 1.分離純化細胞經(jīng)免疫組織化學(xué)鑒定為MSCs;
　　 2.構(gòu)建攜帶有aFGF基因真核表達質(zhì)粒測序結(jié)果與GenBank公布的序列一致，酶切鑒定條帶與實際大小相符;熒光顯微鏡觀察到細胞轉(zhuǎn)染6h后即有綠色熒光發(fā)出，熒光強度和表達細胞總數(shù)在72h達到高峰，傳代后仍可觀察到綠色熒光蛋白表達

18、;G418篩選細胞最佳濃度為300μg/ml，篩選30天仍然觀察到存活細胞;轉(zhuǎn)染后72h，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示目的基因組表達量平均相對比值(aFGF+N1)組(1464.96)顯著高于N1組(1.016)、Blank組(1.000)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot檢測顯示aFGF表達呈極強陽性，而N1組及Blank組aFGF表達極弱。
　　 3.肉眼觀察到A組自身對照可見兩側(cè)脛前肌對稱且無明顯肌

19、萎縮，肌張力正常;B組、C組表現(xiàn)相近:右側(cè)脛前肌部分萎縮，肌張力下降;D組:右側(cè)脛前肌明顯萎縮，肌張力下降最明顯。脛前肌濕重:A組脛前肌濕重為1.213±0.101 g，B組脛前肌濕重為0.950±0.085 g，C組脛前肌濕重0.932±0.070 g，D組脛前肌濕重0.761±0.131 g。 A組明顯高于三個對照組，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性意義。神經(jīng)低頻重復(fù)電刺激檢查:A組所有大鼠神經(jīng)低頻重復(fù)電刺激時沒有出現(xiàn)大的肌電波波幅衰減反應(yīng)，衰減

20、率為6.01±1.50％，沒有出現(xiàn)陽性情況;B組、C組大鼠低頻電刺激時出現(xiàn)較大的肌電波波幅衰減反應(yīng)，但不及D組，3組陽性率均為90％。A組衰減率低于對照組，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性意義。終板染色檢查:A組可見運動終板結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)正常:B組、C組表現(xiàn)相近:失神經(jīng)支配的運動終板形態(tài)不規(guī)則，軸索終末分支減少而雜亂，終板呈細條狀或點狀;D組:未見軸突，運動終板數(shù)量明顯減少，形態(tài)不規(guī)則。
　　 [結(jié)論]
　　 1.兩步酶消化法結(jié)合差速