重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白臨床新靶點(diǎn)研究.pdf

1、重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（簡(jiǎn)稱TNHH）在白細(xì)胞抑制因子（NIF）和水蛭肽（Hirulog）中間加入了一段交聯(lián)肽，能與血凝塊中纖維蛋白結(jié)合的導(dǎo)向性，實(shí)現(xiàn)了降低NIF和Hirulog片段的風(fēng)險(xiǎn)性，增加有效性的目的，能有效抑制白細(xì)胞活化、遷移、粘附功能，抑制凝血酶活性、血細(xì)胞與纖維蛋白結(jié)合。本品在急性缺血性腦卒中動(dòng)物模型中具有多重功效，能有效促進(jìn)腦組織損傷修復(fù)和保護(hù)，改善局部抗凝微循環(huán)和血流再灌注，抑制凝血酶引起的腦水腫，促進(jìn)腦血

2、腫的吸收。
　　目的：
　　探討重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白臨床新靶點(diǎn)。
　　方法：
　　取健康人的纖維蛋白原（FIB）、抗凝血酶III（AT-III）和纖維蛋白溶酶原（PLG）分別與TNHH進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，具體采用免疫印跡鑒別實(shí)驗(yàn)及分別結(jié)合HPLC分析，抗凝血酶III（AT-III）活性分析，D-二聚體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的D-二聚體含量測(cè)定分析判定。在上述實(shí)驗(yàn)判定靶點(diǎn)基礎(chǔ)上，利用CADD（計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)）與

3、可能的新靶點(diǎn)纖維蛋白原（FIB），抗凝血酶III（AT-III）和纖維蛋白溶酶原（PLG）進(jìn)行分子對(duì)接（DOCK），采用PSIPRED2.4，Sybyl8.0和DiscoveryStudio2.5軟件進(jìn)行靶點(diǎn)驗(yàn)證結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH)分別與纖維蛋白原（FIB），抗凝血酶III（AT-III）和纖維蛋白溶酶原（PLG）進(jìn)行免疫印跡鑒別實(shí)驗(yàn)，兔抗TNHH多抗與TNHH+FIB和TN

4、HH+AT-III實(shí)驗(yàn)組的免疫印跡結(jié)果呈陰性，而與TNHH+PLG實(shí)驗(yàn)組的免疫印跡結(jié)果呈陽(yáng)性。鼠抗纖維蛋白原（FIB）單抗，鼠抗凝血酶III（AT-III）單抗分別與TNHH+FIB和TNHH+AT-III實(shí)驗(yàn)組的免疫印跡結(jié)果呈陰性，而鼠抗維蛋白溶酶原（PLG）單抗和TNHH+PLG的免疫印跡結(jié)果呈陽(yáng)性。這說(shuō)明TNHH中不含有纖維蛋白原（FIB）或抗凝血酶III（AT-III），而TNHH中含有維蛋白溶酶原（PLG），表示TNHH與FI

5、B或AT-III無(wú)結(jié)合，而與PLG有結(jié)合。將纖維蛋白原（FIB）與TNHH進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)的HPLC分析，結(jié)果顯示：標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照TNHH的保留時(shí)間為16.335min，峰面積為33578168.000；陽(yáng)性對(duì)照TNHH+兔抗TNHH多抗中TNHH的保留時(shí)間為16.095min，峰面積為13985716.804；實(shí)驗(yàn)組TNHH的保留時(shí)間為15.655min，峰面積為34964292.010；這表明標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照中的TNHH和實(shí)驗(yàn)組中的TNHH峰面積

6、并沒(méi)有太大差異，表明FIB與TNHH無(wú)結(jié)合。將抗凝血酶III（AT-III）與TNHH進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)的AT-III：A活性分析，結(jié)果顯示：標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照AT-III的活性為104.7％，陽(yáng)性對(duì)照AT-III的活性為48%，實(shí)驗(yàn)組AT-III的活性為109.3%，這表明標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照AT-III和實(shí)驗(yàn)組AT-III的活性二者之間并沒(méi)有顯著的差異，說(shuō)明抗AT-III與TNHH無(wú)結(jié)合，不能抑制抗凝血酶III的活性。將纖維蛋白溶酶原（PLG）與TNHH進(jìn)

7、行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)的D-二聚體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果顯示：陽(yáng)性對(duì)照有D-二聚體生成，并且含量為0.246mg/L。實(shí)驗(yàn)組有D-二聚體生成，并且含量為0.068mg/L。這說(shuō)明纖維蛋白溶酶原（PLG）與TNHH有結(jié)合，產(chǎn)生纖維蛋白溶酶，纖維蛋白溶酶催化纖維蛋白降解生成D-二聚體。通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（CADD）的PSIPRED，Sybyl8.0和DiscoveryStudio2.5軟件分析，纖維蛋白溶酶原（PLG）C端的第153位Arg至175

8、位的Tyr為一段保守序列RNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDY與重組白細(xì)胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）的C端的第133位Lys至140位的Tyr為一段保守序列KEGEGVLY在蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)中存在相互作用，而纖維蛋白原（FIB）和抗凝血酶III(AT-III)均沒(méi)有功能核心區(qū)域與TNHH之間有相互作用。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)免疫印跡鑒別實(shí)驗(yàn)，HPLC實(shí)驗(yàn)，AT-III：A活性實(shí)驗(yàn)和D-二聚體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)分析，以