MANF對(duì)β-淀粉樣蛋白和糖氧剝奪-再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡性ER應(yīng)激的抑制作用.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種原發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，起病隱匿，病程進(jìn)展緩慢，是最常見(jiàn)的一種癡呆。目前臨床上尚無(wú)有效的治療措施，隨著本病的進(jìn)展可能導(dǎo)致患者死亡。根據(jù)國(guó)際阿爾茨海默病協(xié)會(huì)2013年公布的最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果，目前全球約有4400萬(wàn)癡呆患者，到2050年患者人數(shù)有可能達(dá)到1.35億[1]。在美國(guó)，AD位于死亡原因的第6位，是65歲以上人群第5大死亡原因，并且患病人數(shù)仍逐年增加[2,3]。至

2、今AD的病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明，眾多研究發(fā)現(xiàn)淀粉樣前體蛋白（APP）、早老素1（PSN1）和早老素2（PSN2）的突變可能導(dǎo)致早發(fā)家族型AD。65歲之后發(fā)病的晚發(fā)型AD與載脂蛋白E密切相關(guān)[4]。AD特征的神經(jīng)病理學(xué)改變?yōu)樯窠?jīng)元外β淀粉樣蛋白在特定腦區(qū)聚集形成老年斑（Senile plaques，SP），Tau蛋白過(guò)度磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（Neurofibrillary tangles，NFTs）。海馬是哺乳動(dòng)物自然發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)細(xì)

3、胞新生的主要區(qū)域之一，也是AD受累的主要腦區(qū)，近年來(lái)越來(lái)越多關(guān)于AD基礎(chǔ)研究及動(dòng)物模型的研究多關(guān)注對(duì)海馬組織的影響。由于獲得正常人及AD患者腦組織標(biāo)本相當(dāng)困難，因此為了研究AD的發(fā)病機(jī)制、開(kāi)發(fā)新的有效治療措施，目前多選用AD細(xì)胞模型及動(dòng)物模型進(jìn)行研究。攜帶APP和PS1雙突變基因的小鼠具有AD主要的神經(jīng)病理學(xué)改變--老年斑的形成，并且具有記憶力減退的特點(diǎn)，是研究AD相對(duì)理想的動(dòng)物模型。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic Reticu

4、lum，ER）功能異常與AD的發(fā)病具有相關(guān)性，從基因水平到蛋白質(zhì)翻譯后修飾，ER應(yīng)激與AD相關(guān)的機(jī)制呈多樣化和復(fù)雜化[5]。在AD患者死后大腦標(biāo)本、AD動(dòng)物模型以及體外細(xì)胞試驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)UPR激活的標(biāo)志，表明ER應(yīng)激和AD之間的有著重要的聯(lián)系[6]。
　　中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF）是一種ER應(yīng)激特異性分泌蛋白，對(duì)

5、ER應(yīng)激敏感，ER應(yīng)激可誘導(dǎo)MANF的表達(dá)，在腦缺血、帕金森病、腦萎縮側(cè)索硬化等神經(jīng)退行性疾病中具有神經(jīng)保護(hù)作用[7-11]，但MANF神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制尚未得到清晰闡明。AD屬于神經(jīng)退行性疾病，蛋白質(zhì)聚集可誘發(fā)ER應(yīng)激反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，MANF抑制Tau蛋白過(guò)度磷酸化誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷[12]；并發(fā)現(xiàn)腦缺血能夠引起神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生ER應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)誘導(dǎo)MANF表達(dá)增高。在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)MANF能促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞增殖，抑制ER應(yīng)激

6、誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而MANF在AD中的功能尚不明確，本研究發(fā)現(xiàn)在攜帶APP和PS1雙突變基因的癡呆小鼠海馬和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中MANF表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)MANF具有抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的作用。
　　目的
　　探討MANF在Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中作用及作用途徑。
　　方法
　　用Aβ1-42處理體外培養(yǎng)的人源神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y細(xì)胞株，誘導(dǎo)神經(jīng)毒性，將細(xì)胞分為四組：正常對(duì)照（n

7、ormal control，NC）組、無(wú)血清（serum-free）組、Aβ1-42組和TM組（陽(yáng)性對(duì)照）。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，用PI染色法檢測(cè)細(xì)胞死亡率，用細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)法觀察MANF和GRP78/BiP的表達(dá)。用免疫組織化學(xué)法觀察MANF在攜帶APP/PS1雙突變基因的癡呆小鼠海馬及大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中的表達(dá)。將MANF過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-MANF-FLAG和MANF-siRNA寡核苷酸序列轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)小鼠來(lái)源的神經(jīng)母

8、細(xì)胞瘤細(xì)胞株N2a細(xì)胞，經(jīng)Aβ1-42誘導(dǎo)神經(jīng)毒性，用Westtern blot法檢測(cè)N2a細(xì)胞轉(zhuǎn)染MANF過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和干擾內(nèi)源性MANF基因后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激相關(guān)蛋白及促凋亡蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1．Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷
　　體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞，經(jīng)不同濃度的Aβ1-42處理不同時(shí)間，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示SH-SY5Y細(xì)胞增殖活性隨Aβ1-42濃度的增加而下降。之后用10μM的Aβ1-

9、42處理SH-SY5Y細(xì)胞不同時(shí)間，MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨Aβ1-42處理時(shí)間增加，細(xì)胞增殖活性下降。對(duì)應(yīng)的，PI染色結(jié)果顯示SH-SY5Y細(xì)胞死亡率隨Aβ1-42濃度的增加而逐漸增加。
　　2．Aβ1-42誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生ER應(yīng)激并誘導(dǎo)MANF表達(dá)上調(diào)
　　用10μM的Aβ1-42處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ER應(yīng)激標(biāo)志性分子伴侶GRP78/BiP、促凋亡蛋白CHOP/GADD153和clea

10、ved caspase-3的表達(dá)增加，并且對(duì)ER應(yīng)激敏感的MANF蛋白表達(dá)亦增多。
　　3. APP/PS1小鼠海馬及其大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中MANF表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性
　　4．MANF對(duì)Aβ1-42神經(jīng)毒性的抑制作用
　　4.1 MANF過(guò)表達(dá)減弱Aβ1-42的神經(jīng)毒性
　　體外培養(yǎng)小鼠來(lái)源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系N2a細(xì)胞系，采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofactamine2000TM瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染MANF過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA

11、3.1-
　　MANF-FLAG以及對(duì)照空載體pcDNA3.1，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后給予10μM的Aβ1-42處理24 h，結(jié)果提示過(guò)表達(dá)MANF可抑制GRP78/BiP、CHOP/GADD153、cleaved caspase-3的表達(dá)。
　　4.2敲減內(nèi)源性MANF基因增加Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性
　　在N2a細(xì)胞中轉(zhuǎn)染敲減MANF的siRNA以及陰性對(duì)照，在轉(zhuǎn)染后給予10μM的Aβ1-42處理24

12、 h。Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲減內(nèi)源性MANF基因可使GRP78/BiP、CHOP/GADD153、cleaved caspase-3的表達(dá)增加。
　　結(jié)論
　　MANF可通過(guò)抑制ER應(yīng)激途經(jīng)引起的細(xì)胞凋亡抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。
　　缺血性卒中是人類(lèi)的主要死亡原因之一，本病發(fā)病率逐年升高，高致殘率及高致死率是本病的特點(diǎn)，尚無(wú)有效的治愈措施。腦缺血能夠誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）功能損傷，誘發(fā)ER應(yīng)

13、激反應(yīng)[37,38]。ER應(yīng)激是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，研究表明ER應(yīng)激參與了腦缺血的病理生理過(guò)程，缺血缺氧可導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加、線(xiàn)粒體及溶酶體損傷，再灌注時(shí)期由于氧自由基大量釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等多種因素作用，可引起細(xì)胞代謝和功能障礙，發(fā)生形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[39-41]。因此ER應(yīng)激在鬧缺血性損傷中具有重要作用[40]。星形膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（mesencephalic astrocyte-d

14、erived neurotrophic
　　factor，MANF）是一種可分泌的小分子蛋白，在ER應(yīng)激時(shí)特異的表達(dá)上調(diào)[11]。MANF的保護(hù)作用機(jī)制尚不十分明確。本研究旨在探索MANF是否通過(guò)抑制ER應(yīng)激反應(yīng)來(lái)保護(hù)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。結(jié)果表明MANF蛋白可顯著改善OGD/R誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞狀態(tài)，提高細(xì)胞存活率，減少促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3的表達(dá)。本研究將為揭示MANF在缺血/

15、再灌注損傷中的保護(hù)機(jī)制，為MANF應(yīng)用于臨床治療缺血性卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：
　　研究MANF對(duì)糖氧剝奪/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)人來(lái)源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y，進(jìn)行糖氧剝奪（OGD）6 h，再灌注（R）12 h。表達(dá)和純化重組人MANF蛋白。在再灌注時(shí)期，根據(jù)是否給

16、予重組人MANF蛋白處理（2?mol·L-1，12 h），將細(xì)胞分為正常對(duì)照組（NC）、NC+MANF組、OGD/R組和OGD/R+MANF組。隨后光學(xué)顯微鏡下觀察SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的改變，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，PI染色法檢測(cè)細(xì)胞死亡率，免疫印跡法檢測(cè)內(nèi)源性MANF蛋白、ER應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α及促凋亡蛋白cleaved caspase-3和CHOP的表達(dá)。用細(xì)胞免疫熒光染色法觀察GRP78

17、/BiP和CHOP的表達(dá)定位。
　　結(jié)果：
　　1．重組人MANF改善OGD/R誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖活性損傷
　　經(jīng)過(guò)不同時(shí)間(0 h、3 h、6 h、8 h、12 h)OGD處理后，給予再灌注12 h處理，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：隨著OGD誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸降低，OGD6 h/R12 h時(shí)，細(xì)胞存活率下降接近50％，OGD大于8 h之后細(xì)胞存活率顯著下降，低至40%以下。OGD+MANF組細(xì)胞增殖活性

18、顯著高于OGD/R組。OGD6 h/R12 h處理后細(xì)胞體積變小，突觸變短或消失，MANF明顯改善該細(xì)胞的狀態(tài)。該結(jié)果表明重組人MANF蛋白對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有抑制作用。
　　2.重組人MANF抑制OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡
　　PI染色可見(jiàn)NC組及NC+MANF組僅有少量PI染色陽(yáng)性細(xì)胞，而OGD/R組PI染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于NC組。OGD/R+MANF組較OGD/R組死亡細(xì)胞數(shù)顯著減少，死亡率下降。該結(jié)果表明重組人

19、MANF蛋白能抑制OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
　　3. OGD/R誘導(dǎo)的ER應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)及MANF的作用
　　用免疫印跡方法檢測(cè)ER應(yīng)激相關(guān)蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，OGD/R組SH-SY5Y細(xì)胞ER應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α、MANF的表達(dá)均明顯高于NC組，給予重組人MANF蛋白處理后，由OGD/R上調(diào)的GRP78/BiP和CHOP的表達(dá)量均有所降低。
　　4. OGD/R誘導(dǎo)的促凋亡蛋白表達(dá)

20、及MANF的作用
　　OGD/R組促凋亡蛋白CHOP表達(dá)增加，該結(jié)果提示OGD/R可能誘導(dǎo)了凋亡性的ER應(yīng)激。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，我們對(duì)Caspase-3進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，激活性的Caspase-3水平也顯著增加。這些結(jié)果提示OGD/R可誘導(dǎo)凋亡性ER應(yīng)激。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，給予重組人MANF蛋白干預(yù)后，由OGD/R上調(diào)的CHOP和cleaved caspase-3的水平被抑制。
　　結(jié)論：
　　1. OG