泡沫病毒與人類免疫缺陷病毒反式激活因子乙酰化的初步研究.pdf

1、乙?；浅姿峄饬硪环N重要的蛋白翻譯后修飾形式,底物蛋白的可逆乙酰化由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白去乙?；?HDACs)催化。這兩種酶可調(diào)控許多種類蛋白的乙?；揎?包括組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架和信號通路蛋白等。而且,這些HATs介導(dǎo)的乙酰化具有多種功能來控制細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控途徑,如細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、核運(yùn)輸和微管形成。近年來,關(guān)于病毒(尤其是慢病毒與DNA腫瘤病毒)利用細(xì)胞內(nèi)乙酰化途徑調(diào)控特異的宿主和/或病毒基因,進(jìn)

2、而激活病毒啟動(dòng)子完成病毒復(fù)制的報(bào)道逐漸增多。人類免疫缺陷病毒(HIV-1)、人T細(xì)胞白血病病毒(HTLV-1)和原型泡沫病毒(PFV)的反式激活因子Tat、Tax和Tas可被不同HATs乙?；?并促進(jìn)了它們的反式激活功能。因此,病毒蛋白的乙?；谄鋸?fù)制和生活周期中具有關(guān)鍵作用。
　　 泡沫病毒(FV)是一種特殊而復(fù)雜的反轉(zhuǎn)錄病毒,屬反轉(zhuǎn)錄病毒科中的泡沫病毒亞科。FV具有廣泛的宿主范圍,從貓、牛、馬到靈長類動(dòng)物均可感染。然而,至今

3、在體內(nèi)尚無FV感染與疾病有緊密聯(lián)系的證據(jù)。FV在tas基因和erv基因的3'端之間具有第二個(gè)啟動(dòng)子,稱為內(nèi)部啟動(dòng)子(IP),這一特性使得FV與其它僅有LTR啟動(dòng)子的反轉(zhuǎn)錄病毒有著明顯的區(qū)別。
　　 PFV的Tas蛋白是其反式激活因子,在病毒轉(zhuǎn)錄激活中具有核心地位,研究發(fā)現(xiàn)其具有乙?；揎棳F(xiàn)象,且乙?；鰪?qiáng)Tas結(jié)合LTR的水平,進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始。牛泡沫病毒BFV于1983年從牛體內(nèi)首次分離到,對BFV基因組進(jìn)行遺傳學(xué)分析表明,這

4、一非靈長類FV與PFV之間具有相似的基因組結(jié)構(gòu)。Btas蛋白含有249個(gè)氨基酸,可結(jié)合LTR和IP并激活轉(zhuǎn)錄。在BFV生活周期中,其反式激活因子Btas蛋白可能起到中心調(diào)控因子和潛伏-裂解感染轉(zhuǎn)換開關(guān)的作用,但其詳細(xì)機(jī)制有待深入探討。因此,PFV Tas的乙酰化現(xiàn)象,在BFV中是否同樣存在,乙?；疊tas的HATs有哪幾個(gè),以及乙?；δ芎驼{(diào)控機(jī)制與Tas的異同又如何,這些問題的闡明有利于從另一角度對泡沫病毒復(fù)制調(diào)控的機(jī)制進(jìn)行比較與研究

5、。
　　 在本文中,我們對于Btas的乙?；揎椇鸵阴；蟮墓δ苓M(jìn)行研究。通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)p300可特異性乙?；疊tas。隨后,為研究Btas是否在體外也是乙?；?我們構(gòu)建了體外乙酰化系統(tǒng),此系統(tǒng)可高效地乙?；M蛋白H3。隨后通過此體外實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)p300 HAT區(qū)蛋白能在體外乙?；疊tas。位于第66、109和110位的賴氨酸是p300乙酰化Btas的底物氨基酸。與野生型相比,Btas乙?；蛔凅w的亞細(xì)胞定

6、位沒有差異。然而,乙?；嚢彼嵬蛔冎率笲tas不能激活LTR和IP啟動(dòng)子。隨后本文對DNA結(jié)合能力是否受Btas乙?；绊戇M(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)p300的乙?；鰪?qiáng)了Btas的DNA結(jié)合能力。有趣的是,Btas的乙?；蛔凅w(K66/109/110R)不能結(jié)合于BFV LTR的DNA應(yīng)答元件。進(jìn)一步凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,K110對Btas結(jié)合DNA是必須的,而Btas DNA結(jié)合水平的提升應(yīng)主要源于K66和K109的乙?；?。上述結(jié)果表明乙酰化

7、賴氨酸對Btas的反式激活功能是十分重要的,而且p300介導(dǎo)的Btas乙?；瘧?yīng)參與了BFV的轉(zhuǎn)錄起始與病毒復(fù)制。
　　 先前報(bào)道表明PFV Tas蛋白與PCAF和p300有相互作用,前者還使Tas發(fā)生乙?；Ｒ虼?本文分析了其它兩種HATs,即CBP和GCN5對Tas轉(zhuǎn)錄激活的影響。在螢火蟲熒光素酶實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)Tas與CBP/GCN5可協(xié)同激活PFVLTR。另一方面,GCN5激活PFV IP也呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng),但CBP對T

8、as激活I(lǐng)P影響不大。隨后,通過將Tas與各種HATs共轉(zhuǎn)染并進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn),鑒定到p300也可乙?；疶as,但其乙?；奖萈CAF要低。這些結(jié)果暗示Tas可能被不同的HATs乙?；?進(jìn)而有利于其行使反式激活功能?？傮w而言,p300對兩種反式激活因子的功能均有促進(jìn)作用。從乙酰化修飾來說,PFV Tas和BFVBtas均可被p300乙?；?但在后者中,p300是Btas的主要乙酰化酶,而p300雖可乙?；?。Tas,其乙?；潭鹊陀赑C

9、AF對Tas的乙?；?體現(xiàn)出這兩種FV對HATs的偏好性是不同的。
　　 HIV-1的反式激活因子Tat同樣存在乙?；揎?多種HATs可以Tat為底物,乙酰化不同的賴氨酸,并使Tat產(chǎn)生不同的功能變化,目前對其乙?；{(diào)控機(jī)制已了解得較為清楚。對于Tat乙?；δ艿难芯?多是基于參考株Tat開展的。與Env相比,雖然。Tat的變異較少,但仍具有一些潛在的涉及功能的突變。HIV-1流行株Tat是否與參考株在乙?；矫嬗兴煌?

10、這些差異能否反映在Tat的功能上,進(jìn)而影響HIV-1的感染性與傳播,同樣值得探討。據(jù)此,本文從天津地區(qū)獲得HIV-1攜帶者的血液樣本,并首先構(gòu)建了感染性克隆,稱為HIV-1天津株。隨后,本文克隆得到天津株Tat,隨同克隆了源于另一美國感染者淋巴結(jié)組織(LN)、基底神經(jīng)節(jié)組織(BG)和腦膜組織(MG)的Tat,對它們的激活水平進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)這些Tat對HIV-1 LTR的激活均比參考株HXB2的Tat高,僅有BG的Tat激活偏低。值得注意

11、的是,天津株Tat對于NF-kB的激活明顯強(qiáng)于參考株,而且其也被p300,CBP,PCAF和GCN5等HATs乙酰化。序列比對的結(jié)果顯示這四株Tat含有賴氨酸突變(如T40K),是潛在的乙酰化位點(diǎn),這些突變可能與這些Tat的乙?；?、病毒的致病性與流行有關(guān)。
　　 綜上所述,我們對于反轉(zhuǎn)錄病毒調(diào)控蛋白的乙?；瘷C(jī)制進(jìn)行了初步研究。對FV和HW-1之間乙酰化途徑的異同點(diǎn)進(jìn)行比較,有助于我們了解乙?；诓《緩?fù)制、病毒宿主相互作用中的