促紅細(xì)胞生成素對腦缺血再灌注大鼠血腦屏障通透性作用機(jī)制的研究.pdf

1、缺血性腦血管病以其高發(fā)病率和高死亡率而嚴(yán)重危害著人們的健康。迅速溶栓進(jìn)行再灌注是治療的關(guān)鍵。但快速溶栓會引起腦組織繼發(fā)性的損害，其主要原因是血腦屏障(blood brain barrier，BBB)通透性遭到破壞。BBB破壞嚴(yán)重，會加重腦水腫。因此應(yīng)用一種能夠降低缺血再灌注后BBB通透性的藥物，對于改善臨床腦缺血患者的預(yù)后是非常有益的。
　　 促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種主要由腎臟分泌的糖蛋白，其

2、主要作用是調(diào)節(jié)血液中紅細(xì)胞的生成。最近研究發(fā)現(xiàn)，在正常人腦和缺血腦組織的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞均有EPO及其受體表達(dá)。利用創(chuàng)傷性腦損傷及缺血再灌注動物模型研究發(fā)現(xiàn)，EPO具有神經(jīng)保護(hù)作用，可以減小腦梗死體積，使BBB通透性下降，減輕腦水腫程度。目前，關(guān)于EPO保護(hù)缺血再灌注后BBB的作用機(jī)制尚不清楚。
　　 緊密連接(tight junction，TJ)是保持BBB完整性的重要結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)。TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occ

3、ludin、claudin-5是目前研究TJ的標(biāo)志蛋白，他們的變化直接影響TJ的狀態(tài)，進(jìn)而影響B(tài)BB的通透性。研究已經(jīng)證明，腦缺血時TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5表達(dá)均減少，TJ完整性下降，細(xì)胞旁通透性增加，直接導(dǎo)致血管源性腦水腫的發(fā)生。
　　 泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的途徑，26S蛋白酶體在這一降解通路中起重要作用

4、。26S蛋白酶體由20S核心蛋白酶和19S調(diào)節(jié)顆粒組成。20S又由2個α亞基和2個β亞基構(gòu)成，其中α亞基主要用于底物的識別，并促使底物進(jìn)入水解中心。在受刺激的細(xì)胞中，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的抑制因子α亞基(IκBα)形成多聚泛素化并被降解，從而使NF-κB活性增強(qiáng)。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)是一種前炎性細(xì)胞因子，與多種疾病的發(fā)生有關(guān)。同

5、時也是NF-κB調(diào)節(jié)的物質(zhì)之一，NF-κB使其表達(dá)活性增強(qiáng)。近年研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α具有調(diào)節(jié)TJ相關(guān)蛋白表達(dá)和降解的作用，因此可以改變BBB通透性。
　　 本研究應(yīng)用腦缺血再灌注大鼠模型，腹腔注射EPO，研究腦缺血再灌注后，EPO對BBB通透性的影響及其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的制備。
　　 2、應(yīng)用激光多普勒血流儀檢測血流變化。
　　 3、氯化三苯基四

6、氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法檢測腦梗死體積百分比，觀察腦組織損傷情況及EPO的影響。
　　 4、伊文氏藍(lán)(evans blue，EB)檢測EPO對腦缺血再灌注BBB通透性的影響，透射電鏡觀察腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間TJ的狀態(tài)。
　　 5、RT-PCR法檢測EPO對缺血再灌注腦組織微血管段的TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5和TNF-α mR

7、NA表達(dá)的變化。
　　 6、免疫組織化學(xué)法檢測EPO對腦缺血再灌注后TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5分布和表達(dá)的作用。
　　 7、免疫組織化學(xué)方法和免疫組織熒光方法檢測EPO對腦缺血再灌注腦組織中20Sα、IκBα分布和表達(dá)的作用。
　　 8、Western blot法檢測EPO對腦缺血再灌注腦組織微血管段的TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-5及20Sα和IκBα表

8、達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　 9、ELISA法檢測EPO對腦缺血再灌注腦組織微血管段的TNF-α濃度的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、腦缺血再灌注3h、72h，EPO使大鼠腦梗死體積顯著降低。
　　 2、腦缺血再灌注3h、72h，缺血區(qū)腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞間TJ開放，BBB通透性顯著升高；EPO基本恢復(fù)了TJ的完整性，使BBB通透性顯著下降。
　　 3、腦缺血再灌注3h、72h，缺血區(qū)腦組織微血管段的TJ

9、相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5 mRNA及其蛋白表達(dá)顯著下降，EPO使三種蛋白表達(dá)顯著升高，并沿腦微血管分布明顯增多。
　　 4、腦缺血再灌注3h、72h，缺血區(qū)腦組織微血管段的TNF-α mRNA表達(dá)上調(diào)及濃度升高，EPO顯著下調(diào)TNF-α mRNA表達(dá)水平并降低其濃度。
　　 5、腦缺血再灌注3h、72h，缺血區(qū)腦組織微血管段的20Sα蛋白表達(dá)和活性顯著升高，EPO使20Sα的表達(dá)顯著降低。<

10、br>　　 6、腦缺血再灌注3h、72h，缺血區(qū)腦組織微血管段的IκBα蛋白表達(dá)顯著降低，EPO顯著抑制缺血再灌注引起的IκBα蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1、腦缺血再灌注后BBB通透性呈現(xiàn)雙峰時相變化，3h和72h分別是BBB通透性最高點(diǎn)，EPO能夠顯著降低腦缺血再灌注后BBB的通透性。
　　 2、腦缺血再灌注后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間TJ開放，TJ相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表