CGRP在大鼠肺動(dòng)脈高壓血管重構(gòu)和博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化中的作用及機(jī)制.pdf

1、第一章降鈣素基因相關(guān)肽在大鼠肺動(dòng)脈高壓血管重構(gòu)中的作用及機(jī)制
　　研究背景：
　　肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺動(dòng)脈壓力增高為主要特征的一類進(jìn)行性疾病，其發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明。血管重構(gòu)是PAH發(fā)生發(fā)展的重要病理生理機(jī)制，而肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs）的過度增殖是引起血管重構(gòu)的關(guān)鍵因

2、素。
　　血管平滑肌細(xì)胞增殖受細(xì)胞周期蛋白(cyclin)及其依賴性蛋白激酶(CDK)和CDK抑制因子(CDKI)的共同調(diào)控。p27作為一種CDK抑制因子，也參與了PASMCs增殖的調(diào)控。研究證明，在低氧性PAH大鼠肺動(dòng)脈p27的表達(dá)明顯下調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)也證明，上調(diào)或過表達(dá)p27均能夠抑制PASMCs的增殖。p27對細(xì)胞增殖的調(diào)控涉及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)信號(hào)途徑，被激活的ERK1/2磷酸化而降解。
　　

3、降鈣素基因相關(guān)肽( calcitonin gene related peptide，CGRP)是感覺神經(jīng)的主要遞質(zhì)，其水平降低可能是促進(jìn)PAH血管重構(gòu)的原因之一，因?yàn)樵赑AH動(dòng)物模型中血漿CGRP水平降低，而外源性給予CGRP或過表達(dá)CGRP均可顯著緩解肺動(dòng)脈高壓的癥狀。此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證明，過表達(dá)CGRP能夠抑制血清誘導(dǎo)PASMCs的增殖。然而，CGRP抑制肺血管重構(gòu)的機(jī)制尚未明了。我們以前的研究證明，CGRP能明顯抑制Angll誘導(dǎo)

4、的主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(ASMCs)的增殖，其機(jī)制與其抑制ERKl/2信號(hào)通路有關(guān)。因此，我們推測CGRP可能通過ERKl/2/p27信號(hào)通路參與了PAH血管重構(gòu)的調(diào)節(jié)。
　　方法：
　　采用低氧(10％ O2)誘導(dǎo)PAH大鼠模型。低氧前4天大鼠皮下注射辣椒素(50 mg/kg/d)，用以耗竭內(nèi)源性CGRP。右頸外靜脈插管測定右心室收縮壓(RVSP)、平均肺動(dòng)脈壓（mPAP）。分離右心室(RV)、左心室加室間隔(LV+S)并

5、稱重，計(jì)算RV/(LV+S)比值。放射免疫法測定血漿CGRP含量。提取肺動(dòng)脈RNA或蛋白，real-timePCR或Westem Blot檢測CGRP、p27、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、c-fos及c-myc的表達(dá)。4％多聚甲醛固定左肺，石蠟包埋，進(jìn)行HE或免疫組化染色。
　　大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞( PASMCs)采用組織塊貼壁法制備。3％O2刺激細(xì)胞增殖。不同濃度CGRP(1、10、100 nM)及CGRP受體阻斷

6、劑CGRP8-37(1μM）預(yù)孵育1h，然后低氧處理48 h。BrdU法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖，real-time PCR或Western Blot檢測p27、p-ERK1/2、c-fos及c-myc的表達(dá)。
　　小分子干擾RAN(siRNA)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。當(dāng)PASMCs匯合達(dá)到70％～80％后，采用lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑將p27 siRNA干擾片段轉(zhuǎn)入細(xì)胞，干擾p27的表達(dá)。Real-time PCR或Weste

7、m Blot檢測干擾效率。干擾24 h后加入CGRP（100 nM）繼續(xù)低氧處理48h。BrdU法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖，real-time PCR或Westem Blot檢測p27、p-ERK1/2、c-fos及c-myc的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　低氧誘導(dǎo)PAH大鼠的RVSP、mPAP較常氧對照組顯著升高；肺動(dòng)脈中膜顯著增厚，而用辣椒素預(yù)先耗竭內(nèi)源性CGRP后能夠加重低氧誘導(dǎo)的上述改變。
　　PAH大鼠CGRP水平

8、顯著降低，上調(diào)肺動(dòng)脈c-fos、c-myc的表達(dá)上調(diào)，而用辣椒素預(yù)先耗竭內(nèi)源性CGRP后能夠進(jìn)一步降低CGRP水平及上調(diào)c-fos、c-myc的表達(dá)。
　　PAH大鼠肺動(dòng)脈p-ERK1/2的表達(dá)水平顯著上調(diào)及p27的表達(dá)顯著下調(diào)，而用辣椒素預(yù)先耗竭內(nèi)源性CGRP后進(jìn)一步上調(diào)p-ERK1/2的表達(dá)及下調(diào)p27的表達(dá)。
　　在培養(yǎng)的PASMCs低氧顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，明顯下調(diào)p27的表達(dá)及上調(diào)p-ERK1/2、c-fos及c-my

9、c的表達(dá)；外源性CGRP(1、10、100 nM)可劑量依賴性的抑制低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，促進(jìn)p27的表達(dá)及抑制p-ERK1/2、c-fos及c-myc的表達(dá)。而CGRP的這些作用可以被CGRP阻斷劑CGRP8-37所取消。
　　p27 siRNA干擾能明顯抑制CGRP介導(dǎo)的p27表達(dá)上調(diào)，但對ERK1/2磷酸化作用不明顯。同時(shí)能逆轉(zhuǎn)CGRP抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs細(xì)胞增殖及c-fos、c-myc的表達(dá)。
　　結(jié)論：

10、　　本實(shí)驗(yàn)確證了耗竭內(nèi)源性感覺神經(jīng)遞質(zhì)CGRP能夠加重低氧誘導(dǎo)的大鼠PAH血管重構(gòu)；CGRP能夠抑制低氧誘導(dǎo)的PAH肺血管重構(gòu)，其機(jī)制可能與抑制ERKI/2的磷酸化，上調(diào)p27的表達(dá)及抑制c-fos和c-myc的表達(dá)有關(guān)。
　　第二章降鈣素基因相關(guān)肽在博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化中的作用及機(jī)制
　　研究背景：
　　肺纖維化（pulmonary fibrosis）是一種涉及多種病因的間質(zhì)性肺疾病，其發(fā)病機(jī)制至今仍未完全清楚。肺成

11、纖維細(xì)胞的增殖與活化以及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過度沉積是其主要病理特征。
　　eIF3是真核翻譯起始因子（eukaryotic initiation factor, eIF）家族中最大的成員之一，在蛋白翻譯、細(xì)胞增殖及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。eIF3a是eIF3中最大的亞基，研究證明，eIF3a在調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞增殖中起重要作用。基于eIF3a在調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞增殖中起重要作用，以及在肺癌組

12、織中表達(dá)較高，我們推測eIF3a可能參與肺成纖維細(xì)胞增殖的調(diào)控，與肺纖維化形成有關(guān)。
　　轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）為強(qiáng)效的促纖維化因子，在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道，TGF-β1促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖活化涉及ERK1/2信號(hào)途徑。研究證明，TGF-β1誘導(dǎo)肺血管平滑肌細(xì)胞增殖與上調(diào)eIF2表達(dá)有關(guān)，而在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞增殖分化過程中伴隨著eIF2

13、α磷酸化水平的升高。本實(shí)驗(yàn)擬探討TGF-β1促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖是否與上調(diào)eIF3a的表達(dá)有關(guān)，以及這一作用是否也受磷酸化的調(diào)節(jié)（如ERK1/2信號(hào)通路）。
　　降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是由37個(gè)氨基酸組成的感覺神經(jīng)肽。文獻(xiàn)報(bào)道，在二氧化硅和石棉誘導(dǎo)的肺損傷并發(fā)肺纖維化的患者，肺組織CGRR的表達(dá)明顯降低。博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化是常用的動(dòng)物模型，博萊霉素誘發(fā)肺纖維化是否涉及CGRP的變化，尚未見報(bào)道。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，CGRP

14、通過ERKI/2信號(hào)通路能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(ASMCs)增殖及低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖，ERK1/2信號(hào)通路在肺成纖維細(xì)胞增殖活化和ECM合成增加中也起著重要作用。因此，我們推測CGRP可能通過影響ERK1/2/eIF3a途徑而抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制肺纖維化的形成。
　　方法：
　　采用博萊霉素(bleomycin，5 mg/kg)誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型。造模前4天大鼠皮下注射Capsaicin

15、(50 mg/kg/d)，用以耗竭內(nèi)源性CGRP。造模后第21天處死動(dòng)物，頸動(dòng)脈采血ELISA法測定血漿TGF-β1含量。提取肺組織RNA或蛋白，real-time PCR或Westem Blot檢測α-CGRP、β-CGRP、TGF-β1、eIF3a、p-ERK1/2、α-SMA、膠原Ⅰ和Ⅲ的表達(dá)。4％多聚甲醛固定左肺，石蠟包埋，進(jìn)行HE、Masson及免疫組化染色。
　　大鼠肺成纖維細(xì)胞采用胰酶消化法制備。波形蛋白免疫組化染色

16、進(jìn)行細(xì)胞鑒定。TGF-β1(5ng/ml)刺激細(xì)胞增殖。當(dāng)肺成纖維細(xì)胞匯合達(dá)到70％～80％后，加入ERK1/2抑制劑PD98059(1μM)預(yù)孵育1h，然后TGF-pi繼續(xù)孵育24h。BrdU法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖，real-time PCR或Westem Blot檢測eIF3a、p-ERK1/2、α-SMA、膠原Ⅰ和Ⅲ的表達(dá)。
　　小分子干擾RAN( siRNA)轉(zhuǎn)染。當(dāng)肺成纖維細(xì)胞匯合達(dá)到70％～80％后，采用lipof

17、ectamin2000轉(zhuǎn)染試劑將eIF3a siRNA干擾片段轉(zhuǎn)入細(xì)胞，干擾eIF3a的表達(dá)。Real-time PCR或Westem Blot檢測干擾效率。干擾24h后加入TGF-β1繼續(xù)孵育24h。BrdU法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖，real-time PCR或Westem Blot檢測eIF3a、p-ERK1/2、α-SMA、膠原Ⅰ和Ⅲ的表達(dá)。
　　當(dāng)肺成纖維細(xì)胞匯合達(dá)到70％～80％后，加入不同濃度CGRP(1、10、10

18、0 nM)及CGRP受體阻斷劑CGRP8-37（1μM）預(yù)孵育1h，然后TGF-β1繼續(xù)處理24 h。BrdU法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖，real-time PCR或Western Blot檢測eIF3a、p-ERK1/2、α-SMA、膠原Ⅰ和Ⅲ的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　博萊霉素誘發(fā)肺纖維化動(dòng)物肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增寬，炎性細(xì)胞浸潤以及纖維組織增生，膠原沉積明顯增多，肺組織TGF-β1、eIF3a、p-ERK1/2、α-

19、SMA、Ⅰ及Ⅲ膠原表達(dá)增高。
　　博萊霉素誘發(fā)肺纖維化動(dòng)物肺組織CGRP表達(dá)顯著降低，當(dāng)預(yù)先用辣椒素處理（耗竭內(nèi)源性CGRP）不僅進(jìn)一步降低肺組織CGRP的表達(dá)，同時(shí)加重博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，以及肺組織TGF-β1、eIF3a、p-ERK1/2、α-SMA、Ⅰ及Ⅲ膠原表達(dá)也進(jìn)一步增高。
　　在培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞上TGF-pi能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，顯著上調(diào)eIF3a、p-ERK1/2、α-SMA、Ⅰ及Ⅲ膠原的表達(dá)。ERK1/

20、2抑制劑PD98059能夠明顯逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖及eIF3a、p-ERK1/2、α-SMA、Ⅰ和Ⅲ膠原的表達(dá)。
　　eIF3a siRNA干擾后能明顯逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞增殖，減弱TGF-β1誘導(dǎo)a-SMA、Ⅰ及Ⅲ膠原的表達(dá)，但對ERK1/2的磷酸化作用則無明顯影響。
　　外源性CGRP(1、10、100 nM)可劑量依賴性的抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞增殖，明顯抑制eIF3a、p-ERK1/