羅格列酮對(duì)博萊霉素所致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈iNOS表達(dá)和iNOS作用的影響.pdf

1、目的：博萊霉素(bleomycin，BLM)是抗腫瘤的化療藥物，其主要副作用是引起肺泡炎和肺纖維化。氣管內(nèi)一次性滴注BLM復(fù)制肺纖維化模型已得到國(guó)內(nèi)外公認(rèn)。肺損傷是引起肺動(dòng)脈高壓的常見(jiàn)原因。目前對(duì)由BLM誘導(dǎo)肺纖維化過(guò)程中肺血管的變化所知甚少。本課題組以往研究結(jié)果顯示：氣管內(nèi)滴注BLM后第14天，大鼠出現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓，肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)受損；羅格列酮(Rosiglitazone，RSG)--過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ(PPAR-γ)

2、激動(dòng)劑能有效地防治BLM誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓?，F(xiàn)已知，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)參與肺動(dòng)脈高壓的形成，但iNOS在BLM所致的肺動(dòng)脈高壓形成機(jī)制中的作用，尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察模型大鼠肺動(dòng)脈壁iNOS表達(dá)、iNOS在肺動(dòng)脈血管反應(yīng)性異常中的作用以及RSG對(duì)上述變化的影響，為闡明BLM誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制和RSG的防治機(jī)制提供資料。 第一部分羅格列酮對(duì)博萊霉素所致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈iNOS表達(dá)的影響 方法：選用免疫組織

3、化學(xué)方法，觀察氣管內(nèi)滴注BLM后第14天，大鼠各級(jí)肺動(dòng)脈iNOS表達(dá)和分布的變化及RSG整體治療以及離體孵育對(duì)肺動(dòng)脈iNOS表達(dá)的影響。健康雄性SD大鼠36只，體重(160～180g)，隨機(jī)分為四組：①NS+NS組大鼠(n=6)：一次性氣管內(nèi)滴入生理鹽水(normal saline，NS，0.5ml/kg)，NS(2ml/d)灌胃14天；②BLM+NS組(n=18)：一次性氣管內(nèi)滴入BLM(5mg/0.5ml/kg)，NS(2ml/d)

4、灌胃14天；③BLM+RSG組(n=6)：一次性氣管內(nèi)滴入BLM(5mg/0.5ml/kg)，RSG(3mg/kg· d溶于NS2ml/d)灌胃14天；④NS+RSG組(n=6)：一次性氣管內(nèi)滴入MS(0.5ml/kg)，RSG(3mg/kg·d溶于NS2ml/d)灌胃14天。 各組大鼠均在氣管給藥后第14天取材。大鼠在10％水合氯醛(3ml/kg，ip.)麻醉后，放血處死。將肺動(dòng)脈及左肺置于新鮮配置的4％多聚甲醛溶液中固定。B

5、LM+NS組有6只大鼠的肺動(dòng)脈立即被置于4％多聚甲醛固定，另12只大鼠的肺動(dòng)脈在體外孵育(DMEM培養(yǎng)液，37℃，5％CO2)24小時(shí)后被置于4％多聚甲醛中固定。體外孵育分兩組：?jiǎn)渭兣囵B(yǎng)液組(DMEM)和RSG孵育組(DMEM中含RSG10μmmol/L)，每組6只大鼠。 固定后的組織經(jīng)石蠟包埋、切片，用于iNOS免疫組織化學(xué)染色。JEDA-801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算iNOS免疫染色陽(yáng)性的平均光密度值及陽(yáng)性面積百分比。整體給

6、藥各組肺動(dòng)脈行HE染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)果： 1、注BLM大鼠肺動(dòng)脈主干iNOS的表達(dá)及RSG的影響 NS+NS組肺動(dòng)脈壁(平滑肌層和內(nèi)皮)有少量iNOS表達(dá)；NS+RSG組肺動(dòng)脈壁(內(nèi)皮和平滑肌層)iNOS表達(dá)與NS+NS組相比，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。BLM+NS組肺動(dòng)脈壁(內(nèi)皮和平滑肌層)iNOS表達(dá)明顯強(qiáng)于NS+NS組(P<0.01)。BLM+RSG組肺動(dòng)脈壁(內(nèi)皮和平滑肌層)iNOS表達(dá)(

7、平均光密度0.33±0.02，陽(yáng)性面積11.03±2.06)弱于BLM+NS組(P<0.05)，但仍強(qiáng)于NS+NS組、NS+RSG組(P<0.05)。離體水平RSG孵育組(DMEM+RSG10μmmol/L)肺動(dòng)脈壁iNOS表達(dá)弱于單純DMEM孵育組(P<0.05)。 2、注BLM大鼠肺內(nèi)動(dòng)脈iNOS的表達(dá)及RSG的影響 肺內(nèi)中等動(dòng)脈(直徑>100μm)：NS+NS組肺內(nèi)中動(dòng)脈有少量iNOS表達(dá)。與NS+NS組相比，NS

8、+RSG組肺動(dòng)脈iNOS表達(dá)無(wú)明顯變化。BLM+NS組肺動(dòng)脈iNOS表達(dá)。BLM+RSG組肺內(nèi)中動(dòng)脈iNOS表達(dá)弱于BLM+NS組(P<0.05)，并且與NS+NS組、NS+RSG組相比，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3、RSG對(duì)BIM所致的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變的影響光鏡下可見(jiàn)NS+NS組、NS+RSG組血管內(nèi)皮細(xì)胞完整，內(nèi)膜連續(xù)，內(nèi)皮下彈力纖維完整，平滑肌層結(jié)構(gòu)整齊；BLM+NS組肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞有脫落，內(nèi)

9、膜不連續(xù)，內(nèi)皮下彈力纖維結(jié)構(gòu)尚可；BLM+RSG組肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷較輕，內(nèi)膜基本完整，內(nèi)皮下彈力纖維完整。 4、小結(jié)：氣管內(nèi)滴入BLM第14天，大鼠肺動(dòng)脈iNOS表達(dá)明顯增加，肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷；RSG阻止肺動(dòng)脈iNOS高表達(dá)，減輕肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。 第二部分羅格列酮對(duì)博萊霉素所致肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈血管反應(yīng)性的影響及iNOS的作用 方法：采用離體肺動(dòng)脈血管環(huán)張力測(cè)定方法和硝基酪氨酸(nitrotyrosin

10、e，NT)免疫組化的方法，觀察羅格列酮對(duì)氣管內(nèi)滴注BLM后第14天大鼠肺動(dòng)脈血管反應(yīng)性的影響及iNOS的作用。 健康雄性SD大鼠67只，體重(160～180g)，隨機(jī)分為六組；各組大鼠均在氣管給藥后第14天取材。 結(jié)果： 1、RSG對(duì)PARs收縮反應(yīng)變化的影響 有內(nèi)皮BLM+NS組PARs對(duì)PE收縮反應(yīng)較有內(nèi)皮NS+NS組明顯減弱(P<0.05)：有內(nèi)皮BLM+RSG組PARs對(duì)PE的收縮反應(yīng)(1.12±

11、0.36 g/mg.d.w)明顯強(qiáng)于有內(nèi)皮BLM+NS組(P<0.05)，與有內(nèi)皮NS+NS組相比，其差異無(wú)顯著性(P>0.05)。無(wú)內(nèi)皮BLM+NS組PARs對(duì)PE的收縮反應(yīng)(0.77±0.22 g/mg.d.w)較無(wú)內(nèi)皮NS+NS組PARs明顯降低(P<0.05)；無(wú)內(nèi)皮BLM+RSG組PARs對(duì)PE的收縮反應(yīng))較無(wú)內(nèi)皮BLM+NS組顯著增強(qiáng)(P<0.05)，與無(wú)內(nèi)皮NS+NS組相比其差異無(wú)顯著性(P>0.05)。提示BLM氣管滴入

12、導(dǎo)致肺動(dòng)脈對(duì)PE的收縮反應(yīng)減弱，RSG對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌有保護(hù)作用，可恢復(fù)肺動(dòng)脈對(duì)PE的收縮反應(yīng)。 2、RSG對(duì)PARs舒張反應(yīng)的影響 有內(nèi)皮BLM+NS組PARs對(duì)Ach的舒張反應(yīng)(0.43±0.14)較有內(nèi)皮NS+NS組PARs(0.93±0.08)顯著降低(P<0.01)。有內(nèi)皮BLM+RSG組PAPs對(duì)Ach的舒張反應(yīng)(0.64±0.20)明顯高于有內(nèi)皮BLM+NS組(P<0.05)，但仍低于有內(nèi)皮NS+NS組(P<

13、0.05)。提示RSG可以部分改善氣管內(nèi)滴入BLM所致的PARs對(duì)Ach的舒張反應(yīng)降低。 3、AG(10-4mol/L)孵育對(duì)PARs反應(yīng)性的影響 無(wú)內(nèi)皮NS+NS組、無(wú)內(nèi)皮BLM+NS組、無(wú)內(nèi)皮BLM+RSG組PARs在AG孵育前后對(duì)PE收縮反應(yīng)性無(wú)明顯變化，提示離體情況下肺動(dòng)脈平滑肌層iNOS-NO對(duì)PARs的收縮反應(yīng)無(wú)明顯影響。有內(nèi)皮NS+NS組、有內(nèi)皮BLM+NS組、有內(nèi)皮BLM+RSG組PARs在AG孵育前后對(duì)

14、PE的收縮反應(yīng)無(wú)明顯變化，提示在離體情況下肺動(dòng)脈內(nèi)皮iNOS-NO對(duì)PARs的收縮反應(yīng)無(wú)明顯影響。 4、L-NAME(10-4mol/L)孵育對(duì)PARs反應(yīng)性的影響 有內(nèi)皮NS+NS組PARs在L-NAME孵育后對(duì)PE的收縮反應(yīng)與孵育前相比明顯增強(qiáng)(P<0.01)；有內(nèi)皮BLM+NS組PARs經(jīng)L-NAME孵育后對(duì)PE的收縮反應(yīng)與孵育前相比無(wú)明顯變化(P>0.05)；有內(nèi)皮BLM+RSG組PARs在L-NAME孵育后對(duì)P

15、E的收縮反應(yīng)與孵育前相比明顯增強(qiáng)(P<0.05)。無(wú)內(nèi)皮NS+NS組、無(wú)內(nèi)皮BLM+NS組、無(wú)內(nèi)皮BLM+RSG組PARs在L-NAME孵育前后對(duì)PE的收縮反應(yīng)性均無(wú)明顯改變。表明BLM+NS組肺動(dòng)脈內(nèi)皮損傷嚴(yán)重，RSG可部分恢復(fù)BLM所致的PARs內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)降低。 5、注BLM大鼠肺動(dòng)脈主干硝基酪氨酸的表達(dá)及RSG的影響 NS+NS組肺動(dòng)脈壁(平滑肌層和內(nèi)皮)有極少量NT表達(dá)(平均光密度0.31±0.01，陽(yáng)性

16、面積6.87±0.56)。BLM+NS組肺動(dòng)脈壁(內(nèi)皮和平滑肌層)NT表達(dá)(平均光密度0.39±0.02，陽(yáng)性面積21.42±1.84)明顯強(qiáng)于NS+NS組(P<0.01)。BLM+RSG組肺動(dòng)脈壁(內(nèi)皮和平滑肌層)NT表達(dá)(平均光密度0.34±0.01，陽(yáng)性面積9.80±0.94)弱于BLM+NS組(P<0.05)，但仍強(qiáng)于NS+NS組(P<0.05)。 6 注BLM大鼠肺內(nèi)動(dòng)脈NT的表達(dá)及RSG的影響 肺內(nèi)中等動(dòng)脈(

17、直徑>100μm)：NS+NS組肺內(nèi)中動(dòng)脈有少量NT表達(dá)(平均光密度0.31±0.01，陽(yáng)性面積5.52±0.83)。BLM+NS組肺動(dòng)脈NT表達(dá)(平均光密度0.38±0.02，陽(yáng)性面積16.47±1.82)強(qiáng)于NS+NS組(P<0.01)。 結(jié)論： 1.氣管滴入BLM第14天肺各級(jí)動(dòng)脈iNOS、NT表達(dá)明顯增強(qiáng)，肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞受損。上述異?？赡茉贐LM誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 2.BLM誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈