綠茶及其提取物與抗生素合用抗MRSA的作用及機制研究.pdf

1、目的：⑴了解來自汕頭和北京地區(qū)的67株MRSA的耐藥情況及耐藥機制，并分析耐藥表型與基因型的一致情況。⑵篩選綠茶抗MRSA的主要成分，觀察綠茶和提取物與抗生素的協(xié)同抗菌情況，并進一步探討綠茶浸出物對MRSA的抗菌機制。⑶測定Ecg/EGCg與β-內酰胺類抗生素對MRSA的協(xié)同抗菌作用，并研究Ecg/EGCg與β-內酰胺類抗生素對MRSA的協(xié)同抗菌作用機制。⑷研究Ecg與四環(huán)素對MRSA的協(xié)同抗菌作用并探討其機制。
　　 方法：①

2、以瓊脂稀釋法測定24種抗菌藥物對MRSA的體外抗菌活性，PCR擴增MRSA的耐藥基因，nitrocefin測定細菌產β-內酰胺酶的情況。②分別測定綠茶、青茶、白茶、紅茶和黑茶對MRSA的MIC，并比較它們對MRSA的抗菌效果；測定茶葉的主要成分茶多酚、茶多糖、茶皂素、茶色素和咖啡因對MRSA的MIC，推測綠茶抗MRSA的主要成分。用紙片擴散法測定綠茶浸出物及其提取物與抗生素抗MRSA的協(xié)同作用。以滲透試驗檢測MRSA 對綠茶的蒸餾水和N

3、aCl 溶液的耐受情況。HPLC 測定綠茶及其提取物對頭孢唑啉在金葡菌菌體內蓄積量的影響。③以微量稀釋法測定Ecg、EGCg和β-內酰胺類抗生素的體外協(xié)同抗MRSA作用。以RT-PCR技術檢測Ecg、EGCg對lytM、lgrA基因表達的影響，并監(jiān)測細菌自溶酶活性的變化。WB法測定EGCg 對MRSA的PBP2a 蛋白的影響。用超聲破碎法提取β-內酰胺酶，測定Ecg和EGCg對β-內酰胺酶的抑制情況，并與三唑巴坦的抑酶作用進行比較。④以

4、微量稀釋法測定Ecg與四環(huán)素的體外抗MRSA協(xié)同作用。用PCR技術篩選tetK基因陽性株和陰性株，以熒光法測定Ecg/EGCg 對tetK外排泵的抑制作用。
　　 結果：⑴67株MRSA除了對氯霉素和多西環(huán)素的耐藥率較低，分別為3％和7.5％，對萬古霉素、米諾環(huán)素和利凡諾100％敏感外，對利福平的耐藥率為52.2％，對四環(huán)素的耐藥率為77.6％，而對于其它包括青霉素、第1-4代頭孢菌素、單環(huán)β-內酰胺類、碳青霉烯類、氨基糖苷類和

5、磺胺類的耐藥率均在80～90％以上，氨芐西林加酶抑制劑以后則耐藥程度有所降低。qacA/B 、mecA、tetM、NorA、gyrA、aac (6’)/aph(2”)、aph (3’) III和β-lactamase檢出率分別為11.9％、95.5％、70.1％、4.5％、10.4％、82.1％、73.1％ 和92.5％ ，未檢出qacC 、ant (6) - Ⅰ、ant (2″)-Ⅰ、VanA和VanB耐藥基因。67株MRSA均攜帶有

6、多種耐藥基因：同時攜帶2種耐藥基因的有7株，3種的有10株，4種的有11株，5種的29株，6種的10株。⑵綠茶浸出物對MRSA的MIC范圍為0.125％～0.5％；青茶浸出物為0.125％～0.5％；白茶浸出物為0.0625％～0.25％；紅茶浸出物為0.5％；黑茶浸出物為0.25～0.5％。茶多酚為128～256μg/ml；茶色素為256～512μg/ml；茶多糖為512～1024μg/ml；茶皂素和咖啡因的MIC 均大于1024μg

7、/ml。綠茶浸出物對青霉素、苯唑西林、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢替唑、米諾環(huán)素和四環(huán)素的抗MRSA 作用有增效作用，與紅霉素和氯霉素呈無關作用，與環(huán)丙沙星呈拮抗作用。茶多糖、茶皂素、茶色素、咖啡因與苯唑西林抗MRSA呈無關作用。茶多酚、Ecg和EGCg與苯唑西林抗MRSA有增效作用。EC與苯唑西林抗MRSA呈無關作用。EC有進一步加強Ecg 對苯唑西林的抗MRSA作用。綠茶浸出物促進MRSA在蒸餾水和NaCl溶液中的破壞。經過綠茶浸出液、

8、茶多酚、EC、Ecg和EGCg預處理的金葡菌體內蓄積的頭孢唑啉明顯增多。⑶50μg/ml 的Ecg/EGCg均能增強苯唑西林、頭孢拉定、頭孢呋辛、美羅培南對MRSA的抗菌作用，其中與美羅培南的協(xié)同效果比苯唑西林、頭孢拉啶和頭孢呋辛明顯。在同等濃度下，Ecg與β-內酰胺類抗生素的協(xié)同效果比EGCg明顯。隨著Ecg和EGCg濃度的增高，MRSA的lytM、lgrA基因表達上調。而且EGCg濃度增加可導致產生的自溶酶增多。25、50和100μ

9、g/ml EGCg可使MRSA-2的PBP2a蛋白表達下調。三唑巴坦對金葡菌β-內酰胺酶有很強的抑制作用，濃度為256μg/ml時可完全抑制金葡菌的β-內酰胺酶，而EGCg/Ecg對金葡菌β-內酰胺酶的抑制作用很微弱，濃度為409.6μg/ml的時，金葡菌β-內酰胺酶仍能使nitrocefin變色。⑷Ecg對MRSA和ATCC25923的MIC均為256μg/ml；四環(huán)素對MRSA的MIC值為2～128μg/ml，對ATCC25923為

10、2μg/ml。合用25μg/ml的Ecg與四環(huán)素后，15株MRSA中有5株呈協(xié)同作用，7株呈相加作用，2株呈無關作用，1株呈拮抗作用。ATCC25923 呈相加作用。經Ecg處理四環(huán)素釋放曲線低于未經Ecg 處理的曲線。
　　 結論：①67株MRSA耐藥情況嚴重，并同時攜帶多種耐藥基因。②五種茶葉對MRSA均有一定的抗菌作用，抗菌較強的是白茶和綠茶。綠茶浸出物能增強β-內酰胺類抗生素和四環(huán)素對MRSA的抗菌作用。綠茶抗MRSA主

11、要成分為茶多酚，而且只有茶多酚才能增強苯唑西林對MRSA的抗菌作用。進一步篩選發(fā)現，茶多酚中的兩個單體Ecg EGCg能增強苯唑西林對MRSA的抗菌作用。而EC能進一步加強Ecg與苯唑西林對MRSA協(xié)同抗菌作用。通過綠茶的蒸餾水和NaCl溶液滲透試驗，我們推斷綠茶浸出物抗MRSA的機制可能與破壞細菌細胞壁有關。綠茶浸出物、茶多酚、EC、Ecg 和EGCg均能促進頭孢唑啉在MRSA和ATCC菌體內蓄積。③Ecg/EGCg與β-內酰胺類抗生