IFN-α對(duì)人初始CD4+T淋巴細(xì)胞中抗病毒因子APOBEC3F表達(dá)影響及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、獲得性免疫缺陷綜合征（acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS）已成為嚴(yán)重危害人類健康的傳染病之一。目前，高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART）雖然能大大降低AIDS的發(fā)病率和死亡率，有效抑制患者體內(nèi)病毒復(fù)制，卻不能徹底清除細(xì)胞內(nèi)特別是潛伏感染儲(chǔ)存庫(kù)中的人免疫缺陷病毒1型（humanimmunodeficiencyvirus-1，HIV-1

2、）。HIV-1潛伏感染已成為治愈AIDS的巨大障礙。
　　載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽家族（apolipoproteinBmRNA-editingenzyme-catalyticpolypeptide，APOBEC）的發(fā)現(xiàn)，使得人們對(duì)于固有免疫系統(tǒng)抑制HIV-1的重要作用有了新的認(rèn)識(shí)。APOBEC家族包括11個(gè)成員，分別是APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A-H、APOBEC4以及活化誘導(dǎo)脫氨基酶（activati

3、on-induceddeaminase，AID)。多數(shù)家族成員能夠在DNA或RNA水平上突變病毒，從而抑制多種逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制，例如HIV-1、鼠白血病病毒、馬傳染性貧血病毒，其中APOBEC3G（A3G）和APOBEC3F(A3F)的抗HIV-1作用最受關(guān)注。靜止初始CD4+T細(xì)胞是HIV-1潛伏感染的主要儲(chǔ)存庫(kù)。研究發(fā)現(xiàn)，雖然A3G/F能夠抑制靜止初始CD4＋T淋巴細(xì)胞中HIV-1的復(fù)制，但這種天然屏障似乎不夠強(qiáng)大。HIV-1病毒感染

4、因子（Virioninfectivityfactor，Vif)可以通過(guò)蛋白酶降解途徑阻止A3G/F整合入病毒顆粒，從而拮抗其抗病毒作用。較前研究顯示增加細(xì)胞內(nèi)A3G/F的表達(dá)量可以有效抑制Vif的拮抗。Keyangchen等發(fā)現(xiàn)IFN-α通過(guò)經(jīng)典的JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)人初始CD4+T細(xì)胞中A3G的表達(dá)量。家族另一成員A3F，被認(rèn)為在組織分布和氨基酸序列上與A3G最接近，而且A3F較A3G具有更強(qiáng)地抑制HIV-1整合和前病毒形

5、成的能力。但I(xiàn)FN-α是否介導(dǎo)人初始CD4+T細(xì)胞中A3F表達(dá)及相關(guān)機(jī)制，至今未有研究。因此，本課題觀察了IFN-α對(duì)初始CD4+T細(xì)胞A3F轉(zhuǎn)錄活性、蛋白表達(dá)的影響，并初步探討其機(jī)制，為利用A3F清除潛伏庫(kù)中HIV-1提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　1、免疫磁珠法分離出人初始CD4+T淋巴細(xì)胞，用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitativereverse-transcriptionpolymerasecha

6、inreaction，qRT-PCR）檢測(cè)IFN-α（1000U/L）刺激不同時(shí)間后，人初始CD4+T淋巴細(xì)胞內(nèi)A3F轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺激3h、5h、7h的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于0h（p<0.0001,Tukey'sTest）。
　　2、WesternBlot法檢測(cè)IFN-α刺激（1000U/L）對(duì)人初始CD4+T淋巴細(xì)胞A3F蛋白表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)IFN-α可以上調(diào)人初始CD4+T細(xì)胞中A3F蛋白的表達(dá)。
　　3、用5′c

7、DNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（5′rapidamplificationofcDNAends，5'-RACE）確認(rèn)A3F轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。結(jié)果顯示可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位（transcriptionalstartsites，TSS)于GenBank公布的A3FcDNA起始位置上游13個(gè)核苷酸（nucleotide，nt）處。
　　4、選擇人基因組DNA為模板，采用高保真Taq酶行PCR法，擴(kuò)增出大小1485bp的A3F啟動(dòng)子，相對(duì)TSS位置為-1

8、472/+13bp。
　　5、構(gòu)建含A3F啟動(dòng)子的pGL3-A3F-prom重組質(zhì)粒，并以此重組質(zhì)粒為模板，采用以PCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變技術(shù)，擴(kuò)增出突變重組質(zhì)粒（GTTTCACTTCTT突變成ATCGATCGATCG）。
　　6、用pGL3-A3F-prom重組質(zhì)粒、突變質(zhì)粒以及pGL3-basic質(zhì)粒（陰性對(duì)照組）轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，采用雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)觀察IFN-α對(duì)A3F啟動(dòng)子活性的影響。發(fā)現(xiàn)IFN-α能夠增強(qiáng)A3

9、F啟動(dòng)子活性（p<0.0001，onewayANOVA），對(duì)mut-A3F啟動(dòng)子活性無(wú)顯著影響（p=0.1479，onewayANOVA）。
　　綜上所述，通過(guò)本研究證實(shí)IFN-α能夠上調(diào)人初始CD4+T細(xì)胞中A3F表達(dá)，并且初步認(rèn)為是通過(guò)作用于A3F啟動(dòng)子干擾素刺激應(yīng)答元件（IFN-stimulatedresponseelement，ISRE）來(lái)實(shí)現(xiàn)的，為深層次研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制打下基礎(chǔ)，并為利用A3F抑制潛伏庫(kù)中HIV-1復(fù)制提