Matriptase和HAI-1與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲遷移及順鉑療效判斷的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　檢測Matriptase和HAI-1基因在三株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，探討Matriptase和HAI-1表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株侵襲遷移能力及細(xì)胞凋亡情況的相關(guān)性。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株，采用Real-time qPCR和Western blot技術(shù)檢測HEC-1A、HEC-1B和RL952三株子宮子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中Matriptase、HAI-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平；構(gòu)建

2、Matriptase基因SiRNA慢病毒載體，采用RNA干擾技術(shù)，對Matriptase高表達(dá)的HEC-1A和RL952細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，從而達(dá)到抑制Matriptase基因表達(dá)水平的目的，并應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及穿膜小室實(shí)驗(yàn)，觀察干擾前后癌細(xì)胞體外侵襲及遷移能力的改變。采用Real-time qPCR及Western blot技術(shù)，檢測不同濃度順鉑作用下Matriptase和HAI-1表達(dá)水平的改變；并采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及穿膜小室實(shí)驗(yàn)測定其

3、侵襲遷移能力的改變，流式細(xì)胞儀監(jiān)測順鉑對腫瘤細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：
　　1.Matriptase mRNA在HEC-1A、HEC-1B和RL952細(xì)胞的相對表達(dá)量分別為（0.2123±0.021）、（6.95E-4±1.2E-4）和（0.1778±0.013），HAI-1mRNA在三株細(xì)胞中的相對表達(dá)量分別為（0.2827±0.049）、（0.0263±0.0043）和（0.2420±0.032）；Matriptase

4、和HAI-1蛋白在HEC-1A和RL952中均呈陽性表達(dá)，但二者在HEC-1B中均為陰性表達(dá)或低于可測水準(zhǔn)，與mRNA水平相吻合。
　　2.采用Matriptase基因SiRNA慢病毒載體（Ma-SiRNA-89873）建立Matriptase低表達(dá)組（Knock down，KD），以加入正常培養(yǎng)基和陰性慢病毒載體NO53分別為空白對照組（Control，CON）和陰性對照組（Negative control，NC）。KD組 Ma

5、triptase mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（HEC-1A：0.2157±0.0124 vs0.0358±0.0111；RL952：0.1849±0.0053 vs0.0341±0.0017），抑制率分別達(dá)到83.4％和81.5%。KD組 HAI-1 mRNA表達(dá)較 CON組均有略微上調(diào)（HEC-1A：0.3142±0.0277 vs0.2900±0.0292；RL952：0.2829±0.0021 vs0.2611±0.0192），但差

6、異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Matriptase和HAI-1蛋白水平改變情況與mRNA水平相一致。
　　3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HEC-1A CON、KD和NC組遷移距離分別為（206.67±28.38）μm、（79.2±6.82）μm和（197.96±16.83）μm；RL952 CON CON、KD89873和NC組遷移距離分別為（184.57±21.97）μm、（76.8±5.48）μm和（175.34±14.73）μ

7、m；P（CON vs KD89873）＜0.001，P（CON vs NC）＞0.05。Person相關(guān)性分析顯示，Matriptase mRNA表達(dá)水平與遷移距離呈正相關(guān)（rHEC-1A=0.97，rRL952=0.982）。
　　4.腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與 CON組相比，KD組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少（HEC-1A：139.25±12.3112 vs48.6±4.8496；RL952：150±7.0710 vs53.3±5.6

8、376），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），NC組穿膜細(xì)胞數(shù)為（HEC-1A：132±8.3120；RL952：145±6.0711），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Person相關(guān)性分析顯示，Matriptase mRNA表達(dá)水平與穿膜細(xì)胞數(shù)亦呈正相關(guān)（rHEC-1A=0.975，rRL952=0.994）。
　　5. Real-time qPCR結(jié)果顯示，不同濃度順鉑處理后Matriptase mRNA表達(dá)水平均表現(xiàn)為低濃

9、度組表達(dá)水平增高（P＜0.05），高濃度組表達(dá)水平降低（P＜0.05）；HEC-1A和RL952細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中HAI-1 mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；HEC-1B細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中HAI-1 mRNA表達(dá)水平呈下降趨勢。各實(shí)驗(yàn)組Matriptase和HAI-1蛋白表達(dá)水平的改變與mRNA相吻合。
　　6.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞不同濃度組改變趨勢相一致，即低濃度組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移距離較空白株明顯增寬（P＜0.

10、05），高濃度遷移距離顯著縮短（P＜0.05）。
　　7.腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞不同濃度組改變趨勢相一致，即低濃度組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)較空白株增多（P＜0.05），中濃度和高濃度組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）。
　　8.流式細(xì)胞儀監(jiān)測結(jié)果顯示，HEC-1A細(xì)胞濃度組（0、2、10、50 mg/L DDP）細(xì)胞存活率分別為84.4%、82.8%、75.0%和41.4%；HEC-1B細(xì)胞濃度組（

11、0、2、10、50 mg/L DDP）細(xì)胞存活率分別為76.9%、73.5%、65.6%和31.8%；RL952細(xì)胞濃度組（0、1、2、5 mg/L DDP）細(xì)胞存活率分別為89.4%、86.3%、65.8%和31.1%；單因素方差分析，三組實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FHEC-1A=34.548，PHEC-1A＜0.001;FHEC-1B=64.141，PHEC-1B＜0.001;FRL952=115.043，P RL952＜0.0

12、01），兩兩方差分析：PHEC-1A（0 mg/L vs2 mg/L）=0.418，PHEC-1B（0 mg/L vs2 mg/L）=0.412，P RL952（0 mg/L vs1 mg/L）=0.418，余P值均小于0.05。
　　結(jié)論：
　　1.應(yīng)用RNAi技術(shù)，特異性下調(diào)Matriptase基因表達(dá)水平，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲遷移能力明顯受限，可見Matriptase表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲遷移能力密切相關(guān)。