輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的克隆、表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞損傷作用的初步研究.pdf

1、目的：本課題構(gòu)建輪狀病毒(Rotavirus，RV)非結(jié)構(gòu)蛋白4(Nonstructural protein4,NSP4)及其第86～175 aa(86 to175 amino acid peptide of nonstructural protein4，NSP486-175)基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、Ni-NTA親和層析純化等方法制備重組蛋白。分析NSP4對(duì)Caco-2細(xì)胞和原代培

2、養(yǎng)的SD大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的損傷作用，進(jìn)一步探討RV對(duì)腸外細(xì)胞的損傷機(jī)制。
　　方法：
　　1.構(gòu)建pET-28a(+)-NSP4和pET-28a(+)-NSP486-175表達(dá)載體膠體金法篩選A群輪狀病毒陽(yáng)性糞便，提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增出目的基因NSP4和NSP486-175，將目的基因與pMD19-T simple vector連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定后送DNA

3、測(cè)序。提取pMD19T-N SP4、pMD19T-NSP486-175和pET-28a(+)質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，T4DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR、質(zhì)粒酶切鑒定及DNA測(cè)序后應(yīng)用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　2.NSP4誘導(dǎo)表達(dá)和純化根據(jù)不同IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間分別對(duì)含有pET-28a(+)-NSP4和pET-28a(+)-NSP486-175的E.coli BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分析

4、最佳誘導(dǎo)條件。收集菌體沉淀，高壓破碎，SDS-PAGE分析蛋白的表達(dá)方式及表達(dá)量。破碎后的上清進(jìn)行Ni-NTA親和層析純化，脫鹽柱脫鹽。取部分純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western blot鑒定。
　　3.RV NSP486-175蛋白對(duì)Caco-2細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子(intracellular free Ca2+，[Ca2+]i)干擾作用用PBS溶解重組蛋白，Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。PBS作為陰性對(duì)照，F(xiàn)luo

5、-3標(biāo)記Caco-2細(xì)胞[Ca2+]i，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)NSP486-175對(duì)[Ca2+]i的干擾。
　　4 NSP486-175蛋白對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷作用分離培養(yǎng)出生24 h的SD大鼠神經(jīng)元細(xì)胞。用不同濃度的NSP486-175刺激成熟的神經(jīng)元細(xì)胞，12h后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。收集細(xì)胞培養(yǎng)液檢測(cè)LDH活力，激光共聚焦顯微鏡觀察添加蛋白前后神經(jīng)元細(xì)胞[Ca2+]i熒光強(qiáng)度和分布改變。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建

6、pET-28a(+)-NSP4和pET-28a(+)-NSP486-175表達(dá)載體PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在500bp和300bp左右有預(yù)期大小的條帶。pET-28a(+)-NSP4和pET-28a(+)-NSP486-175表達(dá)載體分別經(jīng)NcoⅠ、XhoⅠ和NcoⅠ、HindⅢ雙酶切，目的基因均與預(yù)期大小相符。DNA測(cè)序結(jié)果與GenBank: AET43469.1序列一致。
　　2.NSP4誘導(dǎo)表達(dá)和純化完整的N

7、SP4在大腸埃希菌中難以表達(dá)。NSP486-175蛋白主要以可溶性方式存在，相對(duì)分子質(zhì)量為10000。NSP86-175蛋白表達(dá)量在37℃，0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)7h達(dá)到高峰。SDS-PAGE分析NSP486-175蛋白主要存在于菌體破碎離心后的上清中，Ni-NTA親和層析純化用不同濃度咪唑洗脫后發(fā)現(xiàn)200mmol/L咪唑洗脫下來(lái)的目的蛋白最多。純化后的蛋白能與抗His多克隆抗體結(jié)合，Westernblot驗(yàn)證在NC膜上相對(duì)分

8、子量10000處有特異性條帶。
　　3.RV NSP486-175蛋白對(duì)Caco-2細(xì)胞[Ca2+]i干擾作用激光共聚焦顯微鏡觀察到加入NSP486-175前后Caco-2細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度及熒光分布的變化。時(shí)間-平均光密度曲線顯示加入重組蛋白后平均光密度值立即升高，在24s達(dá)到峰值，之后逐漸下降，呈一過(guò)性變化未見(jiàn)第二峰;對(duì)照組加入PBS后無(wú)明顯變化。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度變化差值的比較，t=4.507，P=0.011，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

9、義。實(shí)驗(yàn)組添加NSP486-175蛋白前后熒光強(qiáng)度分析，t=8.211，P=0.015，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，加蛋白后熒光強(qiáng)度增高。
　　4.NSP486-175蛋白對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞損傷作用原代分離培養(yǎng)的新生SD大鼠神經(jīng)元細(xì)胞9d左右成熟，倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞體豐滿，呈不規(guī)則形或梭形，細(xì)胞突起變長(zhǎng)增粗交錯(cuò)成網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好。不同濃度蛋白刺激12 h后，細(xì)胞狀態(tài)變差，細(xì)胞間隙增大，貼壁細(xì)胞減少。培養(yǎng)液中50μg/ml組與對(duì)照組比較L

10、DH活力升高，500μg/ml組LDH升高最明顯。
　　添加NSP486-175蛋白后胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度和分布均有變化。時(shí)間-平均光密度曲線顯示加入重組蛋白后平均光密度值開(kāi)始升高之后逐漸下降，呈一過(guò)性變化未見(jiàn)第二峰;對(duì)照組加入PBS后沒(méi)有明顯變化。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度變化差值的比較，t=3.394，P=0.027，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組添加NSP486-175蛋白前后熒光強(qiáng)度分析，t=4.362，P=0.049，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、意義，加蛋白后熒光強(qiáng)度增高。
　　結(jié)論：
　　1.構(gòu)建輪狀病毒完整的NSP4及其活性片段NSP486-175原核表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)表達(dá)過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了NSP486-175蛋白的大量高效制備。
　　2.NSP486-175蛋白能夠?qū)е翪aco-2細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+失衡，初步證實(shí)具有生物學(xué)活性，可進(jìn)一步用于輪狀病毒腸外損傷機(jī)制的研究。
　　3.外源性添加NSP4后神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)胞膜完整性受到影響，LDH釋放量增高，同時(shí)