輪狀病毒NSP4及其表位肽在膽管閉鎖鼠模型損傷中的作用及機理研究.pdf

1、本課題擬對 NSP4及其 CTL表位激活 CD8+淋巴細胞、繼而形成對膽管上皮細胞的特異性殺傷作用進行研究,從而弄清 NSP4導(dǎo)致膽管上皮細胞損傷的機理,為免疫干預(yù)降低膽道閉鎖的發(fā)生率及改善膽道閉鎖的預(yù)后提供一定的理論依據(jù)。
　　如果能找到 NSP4的CTL表位并有針對性地研制疫苗或抗體,將有望達到預(yù)防或控制輪狀病毒感染的目的而克服輪狀病毒或 NSP4疫苗的致病性,從而為通過免疫干預(yù)降低膽道閉鎖的發(fā)生或改善膽道閉鎖的預(yù)后奠定基礎(chǔ)。

2、
　　第一部分
　　整聯(lián)蛋白α2β1在輪狀病毒致肝外膽管上皮細胞損傷中的作用
　　目的:檢測肝外膽管上皮細胞整聯(lián)蛋白的表達類型并進一步探討其在輪狀病毒致肝外膽管上皮細胞損傷中的作用。
　　方法:取 Balb/c小鼠的肝外膽管進行肝外膽管上皮細胞培養(yǎng)至第三天,用直接免疫熒光法檢測整聯(lián)蛋白α2、β1亞基,用間接免疫熒光法檢測α4亞基。用透射電鏡觀察輪狀病毒與肝外膽管上皮細胞的結(jié)合。然后加入相應(yīng)的整聯(lián)蛋白抗體,再加入輪

3、狀病毒,觀察各組引起的細胞病變(Cytopathic effect,CPE),并進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:用直接免疫熒光法檢測到了整聯(lián)蛋白α2、β1亞基存在于肝外膽管上皮細胞膜表面,用間接免疫熒光法檢測到了α4亞基存在于肝外膽管上皮細胞膜表面。同時透射電鏡觀察到了輪狀病毒與肝外膽管上皮細胞的結(jié)合。加入相應(yīng)抗體阻斷整聯(lián)蛋白α2β1和α4β1后,CPE較對照組明顯減輕,而且 CPE在阻斷α2β1組較阻斷α4β1組減輕更為明顯。

4、>　　結(jié)論:肝外膽管上皮細胞表面表達整聯(lián)蛋白α2、β1和α4亞基并且整聯(lián)蛋白α2亞基的含量可能大于α4亞基的含量,整聯(lián)蛋白α2β1可以介導(dǎo)輪狀病毒感染肝外膽管上皮細胞從而引起細胞損傷。
　　第二部分
　　輪狀病毒 NSP4與整聯(lián)蛋白α2β1在肝外膽管上皮細胞損傷中的作用
　　目的:探討輪狀病毒 NSP4與整聯(lián)蛋白α2β1在肝外膽管上皮細胞損傷中的作用。
　　方法:取 Balb/c小鼠的肝外膽管進行肝外膽管上皮細胞

5、培養(yǎng)至第3天,用激光共聚焦方法檢測整聯(lián)蛋白α2、β1亞基及輪狀病毒 NSP4。用siRNA干擾技術(shù)沉默培養(yǎng)至第3天的肝外膽管上皮細胞的整聯(lián)蛋白α2后加入輪狀病毒,用Real Time RT-PCR方法檢測α2亞基及輪狀病毒 NSP4的messenger RNA(mRNA)含量,并進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:用激光共聚焦方法檢測到了整聯(lián)蛋白α2、β1亞基存在于肝外膽管上皮細胞表面;輪狀病毒 NSP4和整聯(lián)蛋白α2亞基從感染細胞向緊鄰

6、的非感染細胞進行擴散;siRNA干擾技術(shù)表明沉默整聯(lián)蛋白α2后輪狀病毒 NSP4 messenger RNA(mRNA)含量較對照組減低(P<0.05)。
　　結(jié)論:肝外膽管上皮細胞表面表達整聯(lián)蛋白α2、β1且整聯(lián)蛋白α2β1是輪狀病毒NSP4的受體并進一步導(dǎo)致肝外膽管上皮細胞損傷。
　　第三部分
　　輪狀病毒NSP4介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在膽道閉鎖鼠模型損傷中的作用
　　目的:探討表達純化的輪狀病毒NSP4介導(dǎo)的免疫反

7、應(yīng)在膽道閉鎖鼠模型損傷中的作用。
　　方法:對出生后24小時內(nèi)的新生鼠腹腔注射表達純化的輪狀病毒NSP4,分別于腹腔注射后7、14天用胞內(nèi)細胞因子染色法檢測肝臟CD8+淋巴細胞釋放的IFN-γ,用乳酸脫氫酶釋放法檢測CD8+淋巴細胞對培養(yǎng)的肝外膽管上皮細胞(感染RRV與未感染RRV組)的殺傷程度,酶聯(lián)免疫斑點法檢測肝臟淋巴細胞釋放的IFN-γ,用ELISA法檢測小鼠外周血清IFN-γ的含量,并研究剔除CD8+淋巴細胞后肝臟淋巴細胞

8、及外周血清釋放IFN-γ的情況及肝外膽管的損傷程度。
　　結(jié)果:胞內(nèi)細胞因子染色結(jié)果表明NSP4免疫后肝臟C D8+淋巴細胞釋放的I F N-γ含量大于對照組( P<0.05);細胞殺傷實驗結(jié)果表明 NSP4免疫后肝臟C D8+淋巴細胞對肝外膽管上皮細的殺傷效應(yīng)明顯強于對照組( P<0.05),且對感染了RRV的肝外膽管上皮細胞的殺傷效應(yīng)強于未感染 RRV組;酶聯(lián)免疫斑點結(jié)果表明肝臟淋巴細胞釋放的I F N-γ含量大于對照組( P

9、<0.05);外周血清 ELI S A檢測結(jié)果表明 I FN-γ釋放量大于對照組( P<0.05);剔除 C D8+ T淋巴細胞后肝臟淋巴細胞及外周血清釋放的IF N-γ含量明顯降低( P<0.05)并且肝外膽管的損傷程度較阻斷前明顯減輕。
　　結(jié)論:輪狀病毒NSP4介導(dǎo)的CD8+淋巴細胞引起的免疫反應(yīng)在肝外膽管的損傷中具有重要作用。
　　第四部分
　　輪狀病毒NSP4表位肽的預(yù)測與研究
　　目的:研究并明確輪狀

10、病毒NSP4的CTL表位肽。
　　方法:運用生物信息學(xué)方法預(yù)測并固相多肽合成輪狀病毒NSP4的CTL表位肽,對出生后24小時內(nèi)的新生鼠腹腔注射合成的NSP4表位肽及激動劑,分別于腹腔注射后7、14天用胞內(nèi)細胞因子染色法檢測肝臟CD8+淋巴細胞釋放的IFN-γ,用乳酸脫氫酶釋放法檢測CD8+淋巴細胞對培養(yǎng)的肝外膽管上皮細胞(感染RRV與未感染RRV組)的殺傷程度,酶聯(lián)免疫斑點法檢測肝臟淋巴細胞釋放的IFN-γ,用ELISA法檢測小鼠

11、外周血清IFN-γ的含量。
　　結(jié)果:胞內(nèi)細胞因子染色結(jié)果表明NSP4157-170和NSP4144-152較NSP424-32和NSP493-110組肝臟CD8+釋放的IFN-γ明顯增多( P<0.05);細胞殺傷實驗結(jié)果表明NSP4157-170和NSP4144-152較NSP424-32和NSP493-110組肝臟CD8+對肝外膽管上皮細胞的殺傷效應(yīng)明顯強于 NSP424-32和NSP493-110組( P<0.05),且對

12、感染了RRV的肝外膽管上皮細胞的殺傷效應(yīng)強于未感染 RRV組;酶聯(lián)免疫斑點結(jié)果表明NSP4157-170和NSP4144-152較NSP424-32和NSP493-110組肝臟淋巴細胞釋放的I FN-γ明顯增多( P<0.05);外周血清 ELI S A檢測結(jié)果表明 NSP4157-170和NSP4144-152較NSP424-32和NSP493-110組釋放的I FN-γ明顯增多( P<0.05)。
　　結(jié)論:NSP4157-1