rhIL-1α、1，25-(OH)-,2-D-,3-對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG的影響.pdf

1、骨代謝是由成骨細(xì)胞的骨形成與破骨細(xì)胞的骨吸收之間構(gòu)成的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，骨代謝平衡的維持不僅受很多調(diào)節(jié)因素如機(jī)械力、酶等作用，還受細(xì)胞本身活動(dòng)的影響。在牙周組織中，參與牙槽骨改建的功能細(xì)胞除成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞外，還有一種特殊的細(xì)胞牙周膜細(xì)胞。牙周膜細(xì)胞是一組有異質(zhì)性的細(xì)胞群，其中牙周膜成纖維細(xì)胞是牙周膜中最主要的細(xì)胞，研究證明其具有成骨細(xì)胞的許多特點(diǎn)，能表達(dá)多種細(xì)胞因子影響骨代謝活動(dòng)。同成骨細(xì)胞一樣，人牙周膜成纖維細(xì)胞可以通過(guò)表達(dá)破骨細(xì)胞分

2、化因子(receptor activator nuclear factor kappa Bligand，RANKL)和骨保護(hù)因子(osteoprotegerin，OPG)來(lái)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的活動(dòng)。RANKL和OPG均由成骨細(xì)胞/成骨樣細(xì)胞合成和分泌，RANKL是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)配體超家族成員，是一種跨膜蛋白，能與破骨細(xì)胞前體表面唯一的受體核因子-kB活化因子(receptor activat

3、or of nuclearfactor-kappa B，RANK)結(jié)合，通過(guò)一系列酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起破骨細(xì)胞前體分化、增殖和成熟并激活破骨細(xì)胞使其從骨膜中釋放、轉(zhuǎn)移、粘附到骨質(zhì)表面引起骨吸收，而OPG為TNF受體超家族成員，屬于一種可溶性糖蛋白，是RANKL的天然誘餌受體，能競(jìng)爭(zhēng)性地與RANKL結(jié)合，阻斷RANK與RANKL的結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞的生成、分化及其功能，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收作用。RANKL/OPG的比值是骨代謝平衡的重要杠

4、桿，骨微環(huán)境中RANKL與OPG表達(dá)量的相對(duì)比值決定著骨代謝的方向。
　　 牙周膜細(xì)胞通過(guò)RANKL-RANK-OPG調(diào)節(jié)軸調(diào)節(jié)牙周膜細(xì)胞參與骨吸收活動(dòng)，其代謝和功能并不是受單一因素的調(diào)節(jié)和影響。rhIL-1α及1,25-(OH)2D3都是骨代謝調(diào)節(jié)的重要因子，在牙槽骨改建過(guò)程中發(fā)揮重要作用。國(guó)內(nèi)外研究表明rhIL-1α和1,25-(OH)2D3調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG，影響RANKL/OPG比值，間接影響骨

5、代謝平衡。本課題旨在探討rhIL-1α及1,25-(OH)2D3對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG的影響，進(jìn)一步豐富我們對(duì)牙槽骨代謝和改建的認(rèn)識(shí)。
　　 本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligamentfibroblasts，HPDLFs)，鑒定細(xì)胞來(lái)源。并在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平檢測(cè)正常HPDLFsRANKL和OPG的表達(dá)，探討HPDLFs參與調(diào)節(jié)牙槽骨改建的RANKL-OPG通路。初步

6、探討骨代謝調(diào)節(jié)因子rhIL-1α及1,25-(OH)2D3對(duì)HPDLFs表達(dá)RANKL和OPG的影響。本研究將實(shí)驗(yàn)分為以下兩部分：
　　 一、HPDLFs的體外培養(yǎng)與鑒定以及正常HPDLFs RANKL和OPG的表達(dá)
　　 目的：
　　 (1)體外培養(yǎng)HPDLFs并鑒定細(xì)胞來(lái)源，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做好可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 (2)分別從轉(zhuǎn)錄和蛋白水平觀察正常HPDLFs RANKL和OPG的表達(dá)。
　　

7、(3)探討HPDLFs參與牙槽骨改建的RANKL/OPG通路。
　　 方法：
　　 組織貼塊法培養(yǎng)HPDLFs，免疫組化鑒定細(xì)胞來(lái)源。采用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)正常HPDLFs RANKL和OPG在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，同時(shí)使用免疫組化和ELISA法檢測(cè)跨膜蛋白R(shí)ANKL和分泌蛋白OPG的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)成功培養(yǎng)HPDLFs，細(xì)胞來(lái)源可靠。
　　 (2)無(wú)論是轉(zhuǎn)錄還是蛋白水平HPD

8、LFs都分泌和表達(dá)RANKL和OPG，并且OPG的表達(dá)強(qiáng)于RANKL的表達(dá)，以維持牙周膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。
　　 (3)HPDLFs通過(guò)RANKL-OPG通路參與調(diào)節(jié)牙槽骨改建。
　　 結(jié)論：
　　 HPDLFs同成骨細(xì)胞一樣，通過(guò)RANKL-OPG通路調(diào)節(jié)牙槽骨改建。在正常生理情況下，OPG的表達(dá)強(qiáng)于RANKL的表達(dá)，以維持牙周膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。
　　 二、rhIL-1α、1,25-(OH)2D3對(duì)人牙周膜成

9、纖維細(xì)胞表達(dá)RANKL和OPG的影響
　　 目的：
　　 (1)探討骨代謝調(diào)節(jié)因子rhIL-1α對(duì)HPDLFs表達(dá)RANKL和OPG的影響。
　　 (2)初步探討rhIL-1α與1,25-(OH)2D3聯(lián)合作用對(duì)HPDLFs表達(dá)RANKL和OPG的影響，豐富我們對(duì)牙槽骨改建的認(rèn)識(shí)。
　　 方法：
　　 (1)用不同濃度rhIL-1α(0、5、10、20ng/ml)作用于體外培養(yǎng)的HPDLFs，于2

10、4h后收集細(xì)胞，利用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)RANKL mRNA和OPGmRNA的表達(dá)。
　　 (2)10ng/ml rhIL-1α與1×10-8mol/L1,25-(OH)2D3聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的HPDLFs，于48h后收集細(xì)胞，利用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)RANKL mRNA和OPG mRNA的表達(dá)，探討RANKL/OPG比值的變化。
　　 結(jié)果：
　　 (1)HPDLFs在不同濃度rhIL-1α作

11、用下RANKL和OPG mRNA的表達(dá)發(fā)生變化(F=48.870，P＜0.05)。rhIL-1α不僅上調(diào)HPDLFs表達(dá)RANKL mRNA，還同時(shí)穩(wěn)定上調(diào)OPG mRNA的表達(dá)，但其對(duì)RANKL mRNA的調(diào)節(jié)幅度要大于OPG，RANKL/OPG的比值增加，在10ng/ml的作用濃度時(shí)對(duì)RANKL/OPG比值影響最為明顯，C組與B、D組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 (2)rhIL-1α和I,25-(OH)2D3都

12、影響HPDLFs表達(dá)RANKL和OPG。rhIL-1α單獨(dú)作用上調(diào)HPDLFs表達(dá)RANKL和OPG，增加RANKL/OPG比值(P＜0.05)；而1,25-(OH)2D3單獨(dú)作用則上調(diào)表達(dá)RANKL，下調(diào)表達(dá)OPG，增加RANKL/OPG比值(P＜0.05)。這兩種調(diào)節(jié)因子聯(lián)合作用對(duì)HPDLFs RANKL表達(dá)有協(xié)同作用，但對(duì)RANKL/OPG比值的影響無(wú)協(xié)同效應(yīng)(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)rhIL-

13、1α與牙槽骨改建密切相關(guān)，rhIL-1α不僅上調(diào)HPDLFs表達(dá)RANKLmRNA，還同時(shí)穩(wěn)定上調(diào)OPG mRNA的表達(dá)，但其對(duì)RANKL mRNA的調(diào)節(jié)幅度要大于OPG，RANKL/OPG的比值增加。
　　 (2)rhIL-1α和1,25-(OH)2D3都通過(guò)RANKL-OPG途徑調(diào)節(jié)HPDLFs參與牙槽骨改建，兩種調(diào)節(jié)因子聯(lián)合作用對(duì)RANKL表達(dá)的影響明顯優(yōu)于單因素誘導(dǎo)效果，但對(duì)RANKL/OPG比值的影響并沒(méi)有產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)