1，25-（OH）-,2-D-,3-對(duì)脊柱結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞吞噬結(jié)核桿菌的作用研究.pdf

1、目的：通過對(duì)脊柱結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞在1,25-二羥維生素D3(1,25-(OH)2D3)刺激下在結(jié)核桿菌卡介苗(BCG)作用后的一氧化氮(NO)濃度、一氧化氮合酶(NOS)及各亞型的含量隨1,25-(OH)2D3作用時(shí)間及濃度的不同而變化的規(guī)律及各組間的差異性分析，以及對(duì)誘導(dǎo)型NOS(iNOS)、神經(jīng)型NOS(nNOS)、上皮型NOS(eNOS)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的mRNA．含量的變化情況進(jìn)行較全面完整、高靈敏度的定性

2、、定量的隨機(jī)對(duì)照、雙盲實(shí)驗(yàn)，研究1,25-(OH)2D3對(duì)脊柱結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞吞噬結(jié)核桿菌的作用，探討它在脊柱結(jié)核患者對(duì)結(jié)核桿菌的免疫力的影響和作用機(jī)制，為脊柱結(jié)核的臨床治療的新輔助方法的提出提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： ①根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求收集脊柱結(jié)核患者新鮮外周靜脈血標(biāo)本，采用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)BCG作用后，隨機(jī)配對(duì)分成實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組，并分別加入不同濃度的1,25-(OH)2D3及等量DMEM

3、培養(yǎng)基培養(yǎng)，并在0、3、6、9、12、15天收集其培養(yǎng)上清液，利用一氧化氮試劑盒測(cè)定各組NO相對(duì)OD值，分析在不同時(shí)間點(diǎn)和不同1,25-(OH)2D3濃度刺激下NO的變化及變化規(guī)律；用一氧化氮合酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的各組標(biāo)本(實(shí)驗(yàn)組1,25-(OH)2D3終濃度為10-8mol/L)的總NOS和iNOS的含量，分析iNOS和cNOS在各組的時(shí)間變化規(guī)律。 ②在前述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定1,25-(OH)2D3作用的最佳時(shí)間及與

4、濃度的關(guān)系。以同樣方法分離得到單個(gè)核細(xì)胞、分組培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)組加入10-8mol/L的1,25-(OH)2D3)；培養(yǎng)6天后，離心收集細(xì)胞，Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，Real-time PCR擴(kuò)增，對(duì)目的基因iNOS、nNOS、eNOS和TNF-α及參照基因GAPDH的mRNA含量進(jìn)行分析，以相對(duì)定量法即2-△△Ct來比較其差異。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。 結(jié)果： ①脊柱結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)

5、胞在結(jié)核桿菌卡介苗作用后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組NO相對(duì)OD值在細(xì)胞培養(yǎng)第3天逐步升高，到第6天達(dá)高峰，以后逐漸下降至基線。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，在培養(yǎng)第6天，其NO相對(duì)OD值升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在培養(yǎng)第3、9、12天，實(shí)驗(yàn)組NO相對(duì)OD值也高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著1,25-(OH)2D3濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組NO相對(duì)OD值逐步增加，并與1,25-(OH)2D3呈劑量依賴關(guān)系。 ②實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組iNOS的含量明顯高于結(jié)構(gòu)型

6、NOS(eNOS，包括nNOS、eNOS)，cNOS在標(biāo)本中含量很低，且與培養(yǎng)時(shí)間無明顯關(guān)系；兩組中iNOS含量在培養(yǎng)第3天逐步升高，第6天達(dá)高峰，以后逐漸下降，且實(shí)驗(yàn)組iNOS含量與對(duì)照組相比，在培養(yǎng)第6天，其iNOS相對(duì)OD值升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在培養(yǎng)第3天、9天、12天，實(shí)驗(yàn)組NO相對(duì)OD值也高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 ③實(shí)驗(yàn)組iNOS和TNF-α mRNA的2-△△Ct與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但nN