MMPs-TIMPs及炎性因子在SSRIs抗大鼠肺動脈高壓作用中的機(jī)制研究.pdf

1、肺動脈高壓(PAH)是臨床常見的以肺血管阻力進(jìn)行性增加并伴有不可逆的血管構(gòu)型重建為特征的疾病，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致右心室肥厚甚至右心衰竭。其主要病理變化為肺血管收縮性增強(qiáng)，肺血管構(gòu)型重建，肺小血管內(nèi)微血栓形成及肺組織炎癥反應(yīng)。引起肺動脈高壓的原因很多，包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺組織慢性炎癥反應(yīng)、低氧、門脈高壓、HIV感染等。肺動脈高壓的病理機(jī)制復(fù)雜，與多種血管活性因子有關(guān)，如內(nèi)皮素(endothelins，ET)、前列環(huán)素(pros

2、tacyclin)、血栓烷A2(thromboxane A2，TXA2)、一氧化氮(NO)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)等。此外，細(xì)胞炎性因子(如TNF-α，IL-1，IL-6，MCP-1)以及血小板活性改變等都參與PAH的形成。 近年來的研究表明，5-HT作為一種內(nèi)源性血管活性物質(zhì)在PAH發(fā)病機(jī)制中起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，肺動脈高壓患者血漿中5-HT水平明顯高于正常人，體外實(shí)驗(yàn)證明高濃度的5-

3、HT能使人離體肺血管明顯收縮。另外，5-HT作為一種促有絲分裂素，由位于肺動脈平滑肌細(xì)胞膜上的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonintransporter，SERT)介導(dǎo)進(jìn)入肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)，并通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起PASMCs增生肥大，引起肺動脈血管壁構(gòu)型重建。Eddahibi等人研究發(fā)現(xiàn)肺動脈高壓患者PASMCs的SERT表達(dá)比正常人顯著增高。并且，體外研究也發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下，PASMCs的SERT不僅蛋白表達(dá)增加

4、，其活性也是正常氧濃度條件下的2.5-3.0倍。另外，研究發(fā)現(xiàn)家族性肺動脈高壓與SERT的基因多態(tài)性有關(guān)，LL基因型可提高SERT蛋白表達(dá)，并且LL基因型患者比SL和SS基因型患者得肺動脈高壓的風(fēng)險高；此外，SERT基因型也可以預(yù)示慢性阻塞性肺疾病患者的肺動脈高壓嚴(yán)重程度。因此，5-HT及SERT在肺動脈高壓形成和發(fā)展中的重要作用已受到人們越來越多的關(guān)注。 Smoller等人曾提出某些精神疾病(如抑郁癥)與呼吸系統(tǒng)疾病具有相關(guān)性

5、，5-羥色胺能系統(tǒng)可能參與二者的聯(lián)系。研究表明，在患有抑郁癥的病人中，同時患有COPD的病人占有很高比例；同樣，在COPD的病人中，也有高比例的病人同時患有抑郁癥。選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)包括氟西汀、舍曲林、帕羅西汀、西肽普蘭等，是近年來問世的、治療效果良好的抗抑郁癥藥物。其作用機(jī)制明確，SSRIs就是SERT的阻斷劑，它通過阻斷突觸前膜上的SERT，抑制5-HT再攝取，提高突觸間隙5-HT濃度，從而發(fā)揮治療作用。并且

6、，研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)與肺組織中SERT的cDNA有100％的同源性。 上述進(jìn)展表明，肺動脈高壓領(lǐng)域與抑郁癥之間存在某種必然聯(lián)系，而SSRIs是目前治療抑郁癥的有效藥物，但SERT能否成為肺動脈高壓藥物治療新靶點(diǎn)，SSRIs對肺動脈高壓有何影響均不清楚。因此，本論文的研究內(nèi)容包括：(1)SSRIs對野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓的抑制作用；(2)SSRIs抗肺動脈高壓的機(jī)制研究：①SSRIs抑制肺血管構(gòu)型重建作用機(jī)制；②SSRIs抑制肺

7、組織炎癥反應(yīng)機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 建立MCT誘導(dǎo)的慢性肺動脈高壓大鼠模型。用不同種類、不同劑量SSRIs給大鼠灌胃三周后，分別檢測肺動脈壓力，頸動脈壓力，右心肥厚指數(shù)；病理染色的方法檢測肺中小動脈平滑肌增殖指數(shù)，炎性改變，彈性纖維及膠原纖維等血管壁細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)變化；用RT-PCR方法檢測SERT mRNA變化；用Western blot方法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2，MMP-9，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子T

8、IMP-1，TIMP-2及炎性因子IL-1β，MCP-1，TNF-α表達(dá)。用統(tǒng)計分析的方法，比較不同組別各指標(biāo)差異，探討SSRIs抗肺動脈高壓的作用及機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠 慢性PAH大鼠模型成功建立。與對照組相比，平均肺動脈壓從15.3±2.2mmHg升高到28.0±2.1 mmHg(P<0.01)；右心指數(shù)從0.32±0.03增加到0.48±0.08(P<0.01)；比較大鼠肺血管

9、肌化程度，對照組肺動脈中非肌型動脈、部分肌型動脈和肌型動脈所占的比例分別是60.9％，25.5％和13.6％；MCT組分別是49.5％，17.5％和33.0％。 2、SSRIs氟西汀和舍曲林均降低肺動脈高壓、右心指數(shù)及抑制肺血管肌化作用 氟西汀和舍曲林均有效的降低了MCT引起的肺動脈高壓，從MCT組的28.0±2.1mmHg分別降低到25.4 ±2.9mmHg(P<0.05)和23.2±3.1mmHg(P<0.05)；S

10、SRIs降低右心指數(shù)，從MCT組0.48±0.08分別降低到0.41±0.06(P<0.05)和0.42±0.05(P<0.05)；比較血管肌化程度，MCT組大鼠肺動脈中非肌型動脈、部分肌型動脈和肌型動脈各占比例為49.5％、17.5％和33％，氟西汀組為61.8.％、24.6％和13.9％，舍曲林為64.9％、23.6％和11.5％。 3、肺動脈SERT基因表達(dá)變化 MCT組肺動脈SERT mRNA表達(dá)明顯高于對照組，

11、從對照組的O.86±0.08升高至0.99±0.06(P<0.01)。與MCT組比較，氟西汀和舍曲林均減少了SERT mRNA表達(dá)，從MCT組0.99±0.06分別降低至0.89±0.03(P<0.05)和0.82±0.09(P<0.05)。 4、氟西汀劑量依賴性降低肺動脈壓及抑制肺血管壁增厚 氟西汀劑量依賴性的降低了MCT引起的肺動脈高壓，從MCT組29.8±7.5mmHg分別降至26.9 ±5.7mmHg和24.5±

12、3.3 mmHg(P<0.05)；另外，氟西汀劑量依賴的降低了MCT引起的肺血管壁增厚，與MCT組相比，低劑量組管壁厚度從MCT組53.5％±8.8％降至44.7％±9.7％(P<0.01)，而高劑量組管壁厚度則降至38.5％±10.1％(P<0.01 vs MCT)。 5、氟西汀劑量依賴性抑制彈力纖維和膠原增生 用地依紅染色方法觀察血管壁彈力纖維的變化。MCT組血管壁彈力纖維明顯增厚，并且纖維層有斷裂，不完整。與MCT

13、組相比，氟西汀低劑量組和高劑量組肺血管壁彈力纖維層厚度均明顯減低，結(jié)構(gòu)也相對完整；用Van Gieson方法染色觀察血管壁膠原變化。與對照組相比，MCT組血管壁膠原明顯增加，支氣管周圍也有大量彌漫性膠原蛋白，肺組織結(jié)構(gòu)不清楚。氟西汀高劑量組血管壁及支氣管周圍膠原明顯減少，肺組織結(jié)構(gòu)清楚。氟西汀低劑量組膠原也較MCT組減少，并且組織結(jié)構(gòu)相對清楚。 6、氟西汀劑量依賴性降低MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2表達(dá)用We

14、stern blot的方法研究MMP-2，MMP-9，TIMP-1和TIMP-2蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示，MMP-2，MMP-9，TIMP-1和TIMP-2在對照組表達(dá)分別是0.68±0.15，0.59±0.22，0.82±0.08和0.74±0.18，在MCT組分別是1.11±0.15，1.01±0.09,1.03±0.16和1.11±0.17。氟西汀劑量依賴性的降低了各蛋白的表達(dá)，MCT+F2組分別降低到0.95±0.20，0.92±

15、0.14，0.77±0.22和0.90±0.08；MCT+F10組為0.80±0.27，0.73±0.16，0.67±0.18 and 0.87±0.10。 7、氟西汀抑制肺組織炎癥反應(yīng) 與對照組相比，MCT組肺動脈血管壁及肺泡壁明顯增厚，肺組織結(jié)構(gòu)不清，血管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，主要包括中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。氟西汀劑量依賴性的降低肺血管平滑肌細(xì)胞增殖，血管周圍炎性細(xì)胞減少，肺組織結(jié)構(gòu)清楚。 8、

16、氟西汀劑量依賴降低炎性因子TNF-α，MCP-1和IL-1 β表達(dá)用western blot的方法檢測炎性因子蛋白表達(dá)變化。與對照組比較，MCT組中TNF-α，MCP-1和IL-1β蛋白分別從0.58±0.24，0.64±0.11和0.74±0.19提高到1.00±0.22，0.92±0.12和1.16±0.22。而氟西汀劑量依賴性地抑制了炎性因子的蛋白表達(dá)。MCT+F2組TNF-α，MCP-1和IL-1β蛋白表達(dá)分別是0.86±0.1

17、7，0.87±0.26和0.89±0.19，MCT+F10組為0.53±0.29，0.56±0.07和0.79±0.18。 結(jié)論： 1、SSRIs(氟西汀和舍曲林)對MCT誘導(dǎo)的慢性炎癥性肺動脈高壓大鼠模型有明顯的抑制肺血管構(gòu)型重建、減輕右心室肥厚和降低肺動脈壓作用，并且該作用與抑制SERT表達(dá)有關(guān)。 2、氟西汀劑量依賴性的抑制MCT引起的大鼠肺動脈高壓和肺血管構(gòu)型重建。氟西汀減輕肺血管壁ECM膠原和彈力纖維的增