鼻咽癌相關(guān)基因ID2與EMT關(guān)系的初步探討.pdf

1、研究背景和目的：
　　 鼻咽癌(NasoPharyngeal Carcinoma,NPC)是一種主要發(fā)生在我國南方地區(qū)的鼻咽部惡性腫瘤,由于NPC發(fā)生的部位比較隱蔽,早期癥狀常不明顯而容易被忽略,因此確診的患者60％以上都是中、晚期病例,常伴有轉(zhuǎn)移發(fā)生。尋找鼻咽癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的機(jī)制,是我們當(dāng)前研究的主要方向。
　　 腫瘤的形成和侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多階段、多因子參與的復(fù)雜而又連續(xù)的過程,涉及了一些關(guān)鍵的瘤基因和抑瘤基

2、因。在本研究中,我們從公共基因芯片數(shù)據(jù)庫GEO(Gene expression omnibus)中尋找并下載鼻咽癌的相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù),并使用Genclip軟件對其進(jìn)行分析,找到鼻咽癌公共基因芯片數(shù)據(jù)中與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)的基因35個(gè),其中包括本課題所研究的ID2,它在鼻咽癌組織和細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào),提示該基因可能正向參與促進(jìn)了鼻咽癌的發(fā)病過程。
　　

3、ID蛋白家族成員共有四個(gè)ID1,ID2,ID3,ID4,它們最初被發(fā)現(xiàn)在負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞分化方面起了重要作用,后來越來越多的研究證明它們在調(diào)節(jié)譜系定型,基因表達(dá),細(xì)胞命運(yùn),細(xì)胞增殖,以及在神經(jīng)發(fā)生,淋巴組織形成,新生血管形成中細(xì)胞的分化時(shí)間也起了關(guān)鍵作用。ID蛋白家族成員被發(fā)現(xiàn)在很多腫瘤中過表達(dá),比如大腸癌,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,髓母細(xì)胞瘤,神經(jīng)細(xì)胞瘤,胰腺癌,甲狀腺癌,鱗狀細(xì)胞癌,前列腺癌,乳腺癌,子宮內(nèi)膜癌,宮頸癌和黑色素瘤等。
　　

4、為了闡明ID2基因在鼻咽癌發(fā)病中的作用,我們利用RNAi技術(shù)高效、特異的靶向沉默機(jī)制干擾鼻咽癌細(xì)胞SUNE1中ID2表達(dá),建立穩(wěn)定靶向干擾ID2表達(dá)的siRNA鼻咽癌細(xì)胞,以觀察干擾ID2后鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)功能改變,并探尋其與EMT的關(guān)系,為鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制和治療提供新的思路。
　　 方法
　　 1.鼻咽癌EMT 相關(guān)基因的篩選
　　 從公共基因芯片數(shù)據(jù)庫GEO(Gene expression omnibus)中

5、尋找并下載鼻咽癌的相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù),并使用Genclip軟件對下載的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,尋找鼻咽癌公共基因芯片數(shù)據(jù)中與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymaltransition,EMT)相關(guān)的基因；并用生物信息學(xué)方法對篩選出來的基因進(jìn)一步分析。
　　 2.ID2在鼻咽癌中的表達(dá)特性鑒定
　　 免疫組化SP法從蛋白水平檢測ID2在非癌鼻咽組織和鼻咽癌中的表達(dá)水平,初步探討ID2在組織水平與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)

6、系。
　　 熒光定量PCR法從mRNA水平檢測ID2在永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69和鼻咽癌細(xì)胞SIYNE1、5-8F、6-10B、CNE2、HNE1、CNE1、C666-1、HONE1中的表達(dá)水平,初步探討ID2在永生化鼻咽上皮細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)差異,并找到高表達(dá)ID2的鼻咽癌細(xì)胞作為下一步干擾對象。
　　 3.ID2表達(dá)沉默對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)影響及部分與EMT相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測
　　 構(gòu)建ID2慢病毒干

7、擾載體,包裝成成熟的慢病毒顆粒感染高表達(dá)ID2的SLYNE1細(xì)胞,有限稀釋法篩選出穩(wěn)定的陽性和空載克隆,熒光定量PCR檢測各干擾克隆細(xì)胞中ID2干擾效率,篩選干擾效率最高的細(xì)胞克隆并將該細(xì)胞克隆作為實(shí)驗(yàn)對象被進(jìn)一步研究。MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測ID2沉默后對細(xì)胞體外增殖的影響；Transwell檢測ID2沉默后細(xì)胞遷移運(yùn)動能力的改變。
　　 熒光定量PCR法檢測與ID2相關(guān)的TGF-beta以及與EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Slu

8、g,SIP1,Twist,Snail,上皮標(biāo)志物E-cadherin,間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin在四株細(xì)胞株SUNE1/plv-ID2-1,SUNE1/plv-ID2-2,SUNE1/plv,SUNE1中mRNA的表達(dá)水平。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,第二章中因免疫組化各指標(biāo)均為等級資料,故其組間的比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn),ID2的表達(dá)在非癌鼻咽組織和鼻咽癌比較采用Mann

9、-Whitney U檢驗(yàn),ID2的表達(dá)與鼻咽癌臨床分期的關(guān)系檢驗(yàn)用Kruskal Wallis Test,檢驗(yàn)水準(zhǔn)均取雙側(cè)α=0.05；熒光定量PCR法檢測鼻咽癌細(xì)胞株ID2表達(dá)特性結(jié)果比較采用單因素方差分析,多重比較采用SNK檢驗(yàn)。第三章中熒光定量PCR、運(yùn)動、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)采用單因素方差分析；MTT采用析因設(shè)計(jì)的方差分析；多重比較采用SNK或LSD檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果
　　 1.鼻咽癌EMT相關(guān)基因的篩選
　　

10、 在公共的鼻咽癌芯片數(shù)據(jù)中找到35個(gè)與EMT相關(guān)的差異表達(dá)基因,而且這些基因功能大致與細(xì)胞組分、細(xì)胞粘附、通信、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化、運(yùn)動、遷移以及細(xì)胞表面受體相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān),這些功能往往都被認(rèn)為與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　 2.ID2在鼻咽癌中的表達(dá)特性鑒定
　　 1、共收集鼻咽炎組18例、鼻咽癌組52例臨床標(biāo)本。SP免疫組化結(jié)果表明,ID2表達(dá)主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞漿。ID2在鼻咽癌和非癌鼻咽組織中的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)差異(z=-5.553,P=-0.000),ID2的表達(dá)情況與臨床分期沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=0.963,P=0.810)。
　　 2、熒光定量PCR法檢測ID2在永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69和鼻咽癌細(xì)胞SLYNE1、5-8F、6-10B、CNE2、HNE1、CNE1、C666-1、HONE1 mRNA水平表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=2.980,P=0.002),SUNE1表達(dá)最高,表達(dá)量為NP69 ID2表達(dá)量的78倍,作為下一步干

12、擾對象。
　　 3.ID2表達(dá)沉默對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)影響及部分與EMT相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測
　　 1、構(gòu)建ID2慢病毒干擾載體,包裝慢病毒后感染SUNE1細(xì)胞,有限稀釋法篩選GFP+單克隆,熒光定量PCR檢測各克隆的ID2表達(dá)情況,篩選出干擾效率最高的2個(gè)單克隆為下一步實(shí)驗(yàn)的研究對象。陽性克隆的干擾效率與SUNE1和陰性對照細(xì)胞表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=48.693,P=0.000),同時(shí)檢測ID2在陰性對照中的表達(dá)相對

13、于SUNE1強(qiáng)度較一致(0.933±0.006)。陽性干擾克隆命名為SUNE1/plv-ID2-1和SUNE1/plv-ID2-2,陰性對照克隆為SUNE1/plv。
　　 2、MTT法檢測細(xì)胞增殖情況,與陰性對照SUNE1/Plv和SUNE1細(xì)胞相比,干擾克隆細(xì)胞SUNE1/plv-ID2-1和SUNE1/plv-ID2-2的增殖速度明顯減慢并且呈時(shí)間依賴關(guān)系,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=3.301,P=0.000)；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

14、顯示四組細(xì)胞的克隆形成率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=253.434,P=0.000),SUNE1/plv-ID2細(xì)胞克隆形成減少,SUNE1和陰性對照組不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.866)。綜合表明ID2表達(dá)干擾后,SUNE1細(xì)胞體外生長被顯著抑制。
　　 3、Transwell小室檢測結(jié)果顯示,與SUNE1和SUNE1/plv細(xì)胞相比,SUNE1/plv-ID2細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)沒有明顯變化,差異不具有顯著性(F=0.624,P

15、=0.610)。
　　 4、熒光定量PCR法檢測結(jié)果顯示TGF-beta,E-cadherin,Slug,SIP1,Vimentin在4組細(xì)胞間的mRNA表達(dá)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.405,P=0.754；F=0.571,P=0.650:F=0.541,P=0.668；F=0.456,P=0.721；F=0.058,P=0.419),而Twist,Snail在4組細(xì)胞間的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=94.627,P=0.000；F

16、=155.295,P=0.000)。
　　 結(jié)論
　　 1、生物信息學(xué)方法篩選出35個(gè)與鼻咽癌EMT相關(guān)的基因
　　 2、免疫組化SP法證實(shí)ID2的表達(dá)與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系。
　　 3、熒光定量PCR法檢測ID2在永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69和鼻咽癌細(xì)胞SUNE1、5-8F、6-10B、CNE2、HNE1、CNE1、C666-1、HONE1中的表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,S15NE1表達(dá)最高。
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