人參皂甙Rb1對(duì)馬桑內(nèi)酯致癇大鼠海馬組織蛋白質(zhì)組的影響.pdf

1、目的：觀察人參皂甙Rb1（GRb1）對(duì)馬桑內(nèi)酯（CL）所致大鼠癲癇的作用，建立大鼠海馬組織蛋白質(zhì)分離的雙向電泳（2-DE）技術(shù)體系，獲得可能與CL癲癇發(fā)作及GRb1神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)的蛋白質(zhì)成分，探討海馬組織蛋白質(zhì)在癲癇發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用和地位以及GRb1對(duì)其的影響。 方法：選取雄性成年SD大鼠18只，隨機(jī)均分為3組：對(duì)照組、CL致癇組和GRbl+CL致癇組。GRbl+CL致癇組大鼠用GRb1（1．5mg/ml，30mg/kg）

2、每天灌胃1次，連續(xù)3天，第4天腹腔注射CL（1mg/ml，4mg/kg），觀察其行為學(xué)改變。自腹腔注射CL后開(kāi)始計(jì)時(shí)，3小時(shí)后行大鼠腦組織取材。CL致癇組除實(shí)驗(yàn)前3天用等量生理鹽水灌胃外，余處理同GRb1+CL致癇組。對(duì)照組除實(shí)驗(yàn)日腹腔注射等量生理鹽水外，余處理同CL致癇組。各組取半數(shù)動(dòng)物，用2%戊巴比妥鈉麻醉后，開(kāi)胸暴露心臟，經(jīng)左心室用150ml-200ml的生理鹽水快速灌注沖洗，繼以400 ml4%多聚甲醛灌注固定，隨后開(kāi)顱取腦組織

3、置于4%多聚甲醛中后固定過(guò)夜，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。石蠟切片常規(guī)脫蠟，HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元的組織學(xué)改變。各組其余半數(shù)動(dòng)物，斷頭處死并剝離其海馬組織，-80℃保存?zhèn)溆?。海馬組織采用常規(guī)的組織裂解法冰上裂解，提取海馬組織蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，雙向電泳分離蛋白質(zhì)。第一向采用pH4-7的固相pH梯度（IPG）等電聚焦，第二向采用濃度為10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），獲得

4、的凝膠進(jìn)行銀染并經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)采集獲得雙向電泳圖譜，根據(jù)IPG膠條的等電點(diǎn)（pI）線性梯度和標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker，確定蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的pI和分子量（MW），用Image Master2DE Platinum5．0圖像分析軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳圖譜差異分析，以GRb1+CL致癇組凝膠作為參考膠分別與對(duì)照組和CL致癇組凝膠進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)匹配，分別在CL致癇組和GRb1+CL致癇組初步篩選出相對(duì)灰度值變化較大的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)共6個(gè)。切取蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，應(yīng)用基

5、質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS）進(jìn)行檢測(cè)，獲得各蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜，結(jié)合2-DE圖譜中各蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的pI和MW值，利用Mascot軟件進(jìn)行匹配Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，鑒定大鼠海馬組織差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，探討GRb1對(duì)CL致癇大鼠海馬神經(jīng)元蛋白質(zhì)組的影響。 結(jié)果：①大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，參照Dieh1的癲癇分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組大鼠均未見(jiàn)癲癇發(fā)作；CL致癇組大鼠6例均出現(xiàn)Ⅲ-Ⅴ級(jí)發(fā)作，平均可達(dá)Ⅳ級(jí)。GRb1+

6、CL致癇組大鼠4例未見(jiàn)明顯癲癇發(fā)作，2例動(dòng)物出現(xiàn)Ⅰ-Ⅱ級(jí)小發(fā)作。②海馬神經(jīng)元HE染色顯示，對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，邊緣清晰，形態(tài)正常；CL致癇組大鼠可見(jiàn)海馬神經(jīng)元受到損害，尤以CA3區(qū)和齒狀回最明顯，神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，排列不整齊、稀疏，胞漿濃縮、深染，胞核固縮；GRb1+CL致癇組大鼠海馬神經(jīng)元CA1到CA4區(qū)及齒狀回細(xì)胞排列緊密、規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)正常。③獲得重復(fù)性較好的大鼠海馬組織蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜。④篩選出6個(gè)表達(dá)明顯變化的蛋白

7、點(diǎn)并獲得這些蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋譜，成功鑒定出6個(gè)蛋白質(zhì)，分別是：腦肌酸激酶（Brain creatine kinase）、吞蛋白A1（Endophilin-A1）、UPF0628蛋白C10orf96同源物（UPF0628 protein C10orf96 homolog）、細(xì)胞色素P-450（CytochromeP-450）、磷導(dǎo)素樣蛋白（Phosducin-like protein）及橋整合蛋白3（Bridging integrato

8、r3）。其中前三個(gè)蛋白質(zhì)在GRb1+CL致癇組表達(dá)低于CL致癇組，后三個(gè)蛋白質(zhì)在GRb1+CL致癇組表達(dá)低于對(duì)照組。 結(jié)論：①GRb1可減輕CL所致大鼠癲癇的發(fā)作程度和海馬神經(jīng)元的損傷。②CL致癇組、GRb1+CL致癇組和對(duì)照組的表達(dá)蛋白質(zhì)組相比存在明顯差異。鑒定出的6個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能與GRb1的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)，其中Brain creatine kinase、Endophilin-A1、UPF0628 protein C