T-bet-GATA3信號通路與銀屑病中醫(yī)證型的相關(guān)性及中藥治療的機(jī)制研究.pdf

1、銀屑病是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮病，目前多數(shù)學(xué)者傾向于銀屑病是在遺傳易感性的基礎(chǔ)上，自身免疫功能失調(diào)所致以Th1型反應(yīng)為特征的自身免疫性疾病。銀屑病患者中存在Th1及其細(xì)胞因子和Th2及其細(xì)胞因子的不平衡，這種不平衡與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。T-bet/GATA3比率較單-T-bet或GATA3的水平更客觀地反映Th1/Th2分化。因此調(diào)節(jié)T-bet/GATA3的轉(zhuǎn)錄可能是治療Th1/Th2相關(guān)性疾病新的靶位。 消銀湯是我們臨床

2、治療銀屑病的有效方劑，本研究從Th1/Th2及轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA3調(diào)節(jié)作用的角度探討其可能的作用機(jī)制；驗(yàn)證消銀湯的臨床療效、安全性；分析Th細(xì)胞失衡、T-bet、GATA3及相關(guān)信號分子與銀屑病不同中醫(yī)證型的關(guān)聯(lián)性，有助于銀屑病中醫(yī)證型的規(guī)范化、客觀化研究；并運(yùn)用藥物血清作用于HaCaT細(xì)胞后，觀察其對細(xì)胞增殖分化的影響及差異蛋白的表達(dá)去探討消銀湯治療銀屑病的可能作用機(jī)制。 第一部分：T-bet/GATA3信號通路與銀

3、屑病中醫(yī)證型相關(guān)性研究 目的：探討T-bet/GATA3信號通路與銀屑病中醫(yī)證型相關(guān)性。 方法：尋常型銀屑病患者45例，其中血熱型20例，血燥型13例，血瘀型12例，健康對照組10例。抽取銀屑病患者及健康對照者外周血，運(yùn)用RT-PCR檢測T-betmRNA、GATA3mRNA的表達(dá)及T-bet/GATA3，以及運(yùn)用ELASI測定IFN-γ、IL-2、IL─4及IL-10值。 結(jié)果：1．T-bet血熱組與正常組、血

4、燥組、血瘀組相比有顯著性意義(q值分別11.032，4.730，10.133，P＜0.01)，血燥組與正常組、血瘀組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為6.086，4.775，P＜0.01)，血瘀組與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.138，P＜0.01)；2．GATA3血熱組與正常組、血燥組、血瘀組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別2.344，2.226，1.338，P＜0.01)，血燥組、血瘀組及對照組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；3．T/G血熱組與正常組、血燥組

5、、血瘀組相比有顯著性意義(q值分別2.165，1.989，2.137，P＜0.01)，血燥組與正常組、血瘀組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別4.029，1.933，P＜0.01)，血瘀組與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=2.021，P＜0.01)；4．IL-2血熱組與正常組、血燥組、血瘀組相比有顯著性意義(q值分別為11.870，3.177，5.350，P＜0.01)，血燥組與正常組、血瘀組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為9.999，2.591，P＜0.01)，

6、血瘀組與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.118，P＜0.01)；3.663；5．IFN-γ血熱組與正常組、血燥組、血瘀組相比有顯著性意義(q值分別為26.128，12.454，16.496，P＜0.01)，血燥組與正常組、血瘀組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為8.807，3.630，P＜0.01)，血瘀組與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.189，P＜0.01)；6．IL-4血熱組與正常組、血燥組、血瘀組相比有顯著性意義(q值分別為7.408，2.891，3

7、.299 P＜0.01)，血燥組與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.865，P＜0.01)，血燥組與血瘀組間無差別P＞0.05)，血瘀組與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.492，P＜0.01)；7．IL-10血熱組與正常組、血燥組、血瘀組相比有顯著性意義(q值分別為10.619，2.190，2.437，P＜0.01)，血燥組與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=9.001，P＜0.01)，血燥組與血瘀組間無差別(q=0.437，P＞0.05)，血瘀組

8、與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=8.139，P＜0.01)；8．T-bet與IL-2、IFN-γ呈正相關(guān)性，T/G與IL-2、IFN-γ呈正相關(guān)性，與GATA3呈負(fù)相關(guān)性。 結(jié)論：T-bet與Th1型細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ)呈正相關(guān)性，T-bet/GATA3可能成為血熱型銀屑病與非血熱型銀屑病的客觀辨證指標(biāo)之一，并從轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)信號通路水平研究銀屑病不同中醫(yī)證型的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究不僅為銀屑病中醫(yī)辨證分型提供了一定客觀依據(jù)，為

9、中西醫(yī)結(jié)合診治尋常型銀屑病提出了在微觀層次上的結(jié)合點(diǎn)；同時也為中醫(yī)藥治療免疫相關(guān)疾病研究提供了新思路。 第二部分消銀湯對血熱型銀屑病患者的療效及對外周血T-bet/GATA3、Th1/Th2細(xì)胞因子的影響 目的：從消銀湯對血熱型銀屑病患者的療效、PASI評分的變化及血清中細(xì)胞因子影響，探討消銀湯治療銀屑病的可能作用機(jī)制。 方法：觀察20例尋常型銀屑病患者治療前后PASI評分、中醫(yī)辨證評分的變化及外周血中T-bet

10、/GATA3mRNA表達(dá)及TNF-α、IFN-γ及IL-4、IL-10水平變化，并對其水平與皮損嚴(yán)重度作相關(guān)分析。 結(jié)果：銀屑病患者外周血T-bet及T-bet/GATA3、TNF-α、IFN-γ分別為0.1380±．06957、5.5528±0.9686、96.1370±12.2939、32.6410±6.2302，明顯高于健康對照者(P＜0.01)；銀屑病患者外周血GATA3、IL-4、IL-10分別為．1540±．0591

11、0、12.8795±2.6554、12.7660±2.7021，明顯低于健康對照者(P＜0.01)。經(jīng)消銀湯治療后，T-bet、T-bet/GATA3及Th1型細(xì)胞因子較治療前明顯下降，而Th2型細(xì)胞因子水平治療前較正常人水平低，治療后與治療前改變無明顯差異性。T-bet/GATA3、Th1型細(xì)胞因子水平和銀屑病皮損嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性。 結(jié)論：銀屑病是以Th1型細(xì)胞因子水平升高，Th2型細(xì)胞因子水平下降為特點(diǎn)的Th1/Th2偏移

12、的免疫性疾病，消銀湯可能通過抑制Th1免疫反應(yīng)相對地逆轉(zhuǎn)銀屑病的Th1/Th2反應(yīng)失衡從而達(dá)到治療銀屑病的作用。 第三部分中藥藥物血清對表皮生長因子誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞生長增殖的影響 目的：探討中藥消銀湯藥物血清對表皮生長因子誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞生長增殖的影響 方法：以HaCaT細(xì)胞為靶細(xì)胞，觀察中藥消銀湯藥物血清對10ng/ml EGF信號刺激下HaCaT細(xì)胞生長曲線的影響；用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況；用流式細(xì)

13、胞術(shù)測定細(xì)胞周期及凋亡率變化。 結(jié)果：中藥消銀湯藥物血清影響EGF信號刺激下HaCaT細(xì)胞的生長狀態(tài)并抑制其生長速度；不同濃度消銀湯處理的HaCaT細(xì)胞，48h時表現(xiàn)出對細(xì)胞增殖的抑制作用，隨著時間延長和藥物劑量加大，抗增殖作用愈明顯；高濃度組，48h和72h時的抑制率分別為59.47％和73.76％。與對照組相比，經(jīng)消銀湯作用48h后，細(xì)胞G1期比例顯著增加，S期與G2期比例則顯著下降，并可抑制G1/G2期轉(zhuǎn)換，但對細(xì)胞凋亡無

14、影響。 結(jié)論：消銀湯具有抑制EGF誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其分化的作用。 第四部分消銀湯藥物血清作用HaCaT細(xì)胞后差異蛋白的表達(dá) 目的：通過中藥消銀湯藥物血清作用HaCaT細(xì)胞后蛋白差異表達(dá)的比較，尋找中藥藥物血清對角質(zhì)形成細(xì)胞作用機(jī)制的相關(guān)蛋白，為消銀湯用于治療銀屑病提供理論依據(jù)。 方法：應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)，藥物血清與HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)后取上清，蛋白質(zhì)抽提，蛋白質(zhì)定量，細(xì)胞因子檢測，X-射線膠片曝

15、光后，將膠片上的圖象用掃描儀掃描并轉(zhuǎn)換為灰度TIFF格式的圖片文件保存。運(yùn)行ScanAlyze軟件，將灰度TIFF格式圖片的點(diǎn)陣轉(zhuǎn)化為數(shù)字型數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析使用芯片配套軟件GEArray Analyzer對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去背景計(jì)算及比較運(yùn)算。將同組實(shí)驗(yàn)的2張芯片的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，篩選出差異的蛋白。 結(jié)果：上調(diào)2倍以上的蛋白有ALK、ErbB4、EphA4、EphA2、CSK；下調(diào)的蛋白有ABL1、ACK1、AXL、BLK、EGFR、E