RhNRG-1通過增加心肌特異性MLCK的表達(dá)而改善心梗大鼠心功能.pdf

1、Neuregulin (NRG) 家族的基因有四個，其中NRG-1在神經(jīng)、心臟和乳腺等系統(tǒng)或組織中發(fā)揮重要的作用。rhNRG-1 (recombinant human NRG-1)激活心肌細(xì)胞上的ErbB2/4受體后，能改善心梗大鼠的心功能，但其機(jī)制尚不夠清楚。 本課題通過基因芯片篩選，并經(jīng)過Real time PCR、Western blot驗證后，發(fā)現(xiàn)rhNRG-1能增加一個預(yù)測的基因的表達(dá)：Similar to Myosi

2、n light chainkinase 2， skeletal/cardiac muscle (MLCK2) (GenBank accession numberXM_214645)。采用Northern、Western blot和Immunofluorescence等方法，證明該基因特異性分布于心肌細(xì)胞，并進(jìn)一步證明它能使mlc-2v(Myosin lightchain-2，ventricular)磷酸化，說明它是心肌特異性的MLCK，

3、干擾其RNA表達(dá)后，rhNRG—l恢復(fù)受損心肌細(xì)胞的作用消失。初步證明rhNRG-1能增加心肌細(xì)胞特異性MLCK的表達(dá)，從而改善心功能。 本課題共分五個部分： 第一部分 rhNRG-1能改善心梗大鼠的心功能。 結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支，建立心梗模型，根據(jù)EF值(左室射血分?jǐn)?shù))隨機(jī)分為rhNRG-1 治療組、賦形劑對照組，連續(xù)靜脈滴注rhNRG-1(10μg/kg/2h x7天)或同等體積賦形劑，于用藥前、后分別進(jìn)行

4、心超檢測。同步設(shè)立假手術(shù)組：開胸但不結(jié)扎冠狀動脈，也不給予任何藥物。結(jié)果：用藥后rhNRG-1組LVEDD(左室舒張末內(nèi)徑)、LVEDS(左室收縮末內(nèi)徑)、EF、FS(左室縮短分?jǐn)?shù))分別為9.46±0.20mm、7.62±0.23ram、44.7±1.9％、19.8±1.1％，與賦形劑組相比，LVEDD、LVEDS分別下降了9.1％、18.8％，而EF、Fs分別升高了62.5％、75.1％(P<0.01，n>10)。證明rhNRG-1能

5、改善心梗大鼠的心功能。 第二部分 大鼠心肌基因芯片檢測及相關(guān)驗證表明：rhNRG-1 能使Similar MLCK表達(dá)增加。 1. 基因芯片檢測： 選取第一部分實驗動物的左室非梗區(qū)，每組取3只，獨立提取RNA，共9份RNA樣品，分別與9張基因芯片雜交(Rat Genome 230 2.0 Arrays，Affymetrix)。結(jié)果提示，rhNRG-1能增加一個預(yù)測基因的表達(dá)：Similar to Myosin l

6、ight chainkinase 2，skeletal/cardiac muscle(MLCK2)(GenBank accession numberXM_214645)。當(dāng)假手術(shù)組標(biāo)化為1.000時，賦形劑組為0.677，而rhNRG-1組為1.652，rhNRG-1/賦形劑比值為2.441，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01，n=3)。 2. Real time PCR和Western blot驗證了基因芯片的結(jié)果： Simi

7、lar MLCK N端1400bp是特異性的片斷，故選取1018-1317片斷，采用Real time PCR驗證了其基因變化。選用487-885片斷，構(gòu)建Similar MLCK-GST/pGEX-2T 質(zhì)粒，表達(dá)similar MLCK (487-885)-GST融合蛋白，免疫兔子獲得高效價抗體，進(jìn)行Western blot驗證了其蛋白水平的變化。結(jié)果與基因芯片的結(jié)果相吻合，證明rhNRG-1確實增加了該基因的表達(dá)。 第三部

8、分 大鼠Similar MLCK特異性分布于心肌細(xì)胞 1. Northern blot：選取Similar MLCK 238-885片斷作為探針，用α-<'32>PdCTP標(biāo)記后，與大鼠多種組織northern雜交膜進(jìn)行雜交，結(jié)果只在心肌組織中有單一的條帶(約4.3kb)。 2. Western blot：采用第二部分試驗中制備的similar MLCK抗體，與大鼠多種組織蛋白進(jìn)行雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)similar MLCK只

9、在心肌組織中表達(dá)(約86kd)。 3.Immunofluorescence：新生大鼠原代心肌細(xì)胞未純化培養(yǎng)后免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)：similar MLCK只分布于心肌細(xì)胞，smooth MLCK分布于心肌組織內(nèi)的平滑肌細(xì)胞。成年大鼠心臟冰凍切片免疫熒光顯示：similar MLCK分布于心肌細(xì)胞，而smooth MLCK分布于血管組織。 綜合上述結(jié)果，可以證實：similar MLCK特異性分布于心肌細(xì)胞。 第四部分

10、 大鼠Similar MLCK能使MLC-2v磷酸化，是心肌特異性MLCK。 構(gòu)建大鼠cardiac MLCK/pCDNA3表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染cos7細(xì)胞后，收集細(xì)胞裂解液作為cardiac MLCK的來源，加入體外反應(yīng)體系(含有MLC-2V，以及Ca<'2+>，CaM，ATP等物質(zhì))，觀察mlc-2v的磷酸化。結(jié)果表明：Cardiac MLCK能使mlc-2v磷酸化且必須依賴Ca、 CaM的存在。Cardiac MLCK用量相同時

11、，隨著作用時間的延長，mlc-2v磷酸化水平越高，20min時能檢測到磷酸化，100min時基本達(dá)到飽和。在相同作用時間下，隨著Cardiac MLCK用量的增加，mlc-2v磷酸化水平越高。作用時間相同、Cardiac MLCK用量一樣時，不同溫度下mlc-2v磷酸化無明顯變化。特異性分布于心肌細(xì)胞的Similar MLCK能使MLC-2v磷酸化，且有明顯的量效和時間關(guān)系，證實了similar MLCK是心肌特異性MLCK。

12、第五部分 rhNRG-1通過增加cardiac MLCK的表達(dá)而改善心功能。 1.篩選有效的 cardiac MLCK RNA表達(dá)干擾片段：針對cardiac MLCK CDS區(qū)156-174 (GcTACAGTGTGTGTGCCAA) 等片斷，構(gòu)建RNAi Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ質(zhì)粒 (pRNAT-CMLCK-Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ)，然后分別與cardiac MLCK/pCDNA3表達(dá)質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)染cos7細(xì)胞，用Western blot檢測car

13、diac MLCK的變化。結(jié)果：RNAi Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ質(zhì)粒分別使cardiac MLCK的表達(dá)下降80％，50％，20％，提示RNAi Ⅰ質(zhì)粒干擾效果最好。 2．rhNRG-1通過增加cardiac MLCK的表達(dá)而改善心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)：干擾或?qū)φ召|(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)心肌細(xì)胞后，會有GFP綠色熒光，借助α-actinin染色能顯示心肌細(xì)胞的橫紋結(jié)構(gòu)，通過圖像分析系統(tǒng)將橫紋紊亂的面積分為不同等級：Area<25％，25％≤area<50％，50％

14、≤area<75％，area≥75％，統(tǒng)計各級細(xì)胞數(shù)量，分析比較各組橫紋結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果：正常、正常+RNAi Ⅰ、無血清+對照質(zhì)粒、無血清+對照質(zhì)粒+rhNRG-1、無血清+rhNRG-1+RNAi Ⅰ組內(nèi)，紊亂面積≥50％的細(xì)胞分別為2％、80％、60％、28％、80％。說明cardiac MLCK的表達(dá)受干擾后，正常細(xì)胞的橫紋排列紊亂；無血清培養(yǎng)能使心肌細(xì)胞橫紋排列紊亂，rhNRG-1能恢復(fù)紊亂的橫紋；Cardiac MLCK表達(dá)

15、被干擾后，rhNRG-1恢復(fù)紊亂橫紋的作用消失。說明rhNRG-1可通過增加cardiac MLCK的表達(dá)而恢復(fù)心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改善心功能。 結(jié)論： 1．Similar MLCK(GenBank accession number XM_214645)可稱作Cardiacspecific M1CK，這是一個新的MLCK的發(fā)現(xiàn)。 2． rhNRG-1能改善心梗大鼠的心功能。 3．rhNRG-1 能使Car

16、diac specific MLCK表達(dá)增加。 4． Cardiac MLCK表達(dá)被干擾后，rhNRG-1恢復(fù)受損心肌細(xì)胞的作用消失。 5． rhNRG-1 增加 cardiac MLCK的表達(dá)，從而改善心肌收縮功能。 潛在價值和創(chuàng)新點： 1．Similar MLCK(GenBank accession number XM_214645)可稱作 Cardiacspecific M1CK，這是一個新的MLC