LIM礦化蛋白-1對(duì)脊柱韌帶骨化作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊柱韌帶組織一般由成纖維細(xì)胞構(gòu)成，成纖維細(xì)胞能分泌膠原及粘多糖等一些物質(zhì)。脊柱韌帶組織在生理狀態(tài)下呈一種動(dòng)態(tài)與靜態(tài)平衡，一般不會(huì)向骨化方向進(jìn)展。但在某些因子刺激下，成纖維細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞分化的能力，并具有成骨細(xì)胞分泌功能。LIM礦化蛋白-1(LIM mineralization protein1，LMP-1)是一種細(xì)胞內(nèi)的非分泌蛋白，在胚胎骨發(fā)育及骨細(xì)胞的分化過程中起著重要作用，是一種正調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)量的改變能影響骨細(xì)胞的生長及分化

2、，與異位成骨等多種骨性疾病有著密切的聯(lián)系。研究顯示:LMP-1可由多種細(xì)胞分泌，為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其直接作用于細(xì)胞核，啟動(dòng)相關(guān)基因片段發(fā)揮生物學(xué)作用。根據(jù)胚胎細(xì)胞分化及發(fā)育研究表明，骨組織與牙本質(zhì)具有相同的起源，LMP-1在骨組織和牙本質(zhì)的細(xì)胞分化、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和礦化過程中有重要的作用，與成骨及牙本質(zhì)骨化等過程密切相關(guān)。LMP-1可能對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)及Runx2具有調(diào)控作用，在骨化及異位成骨具有重要的作用，但其調(diào)控機(jī)

3、制尚不明了。本課題采用免疫組織化學(xué)染色及RT-PCR技術(shù)測定LMP-1及mRNA在頸椎后縱韌帶中的表達(dá)水平，探索LMP-1對(duì)成骨調(diào)控作用的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　目的:
　　1、分析頸椎后縱韌帶骨化患者與非頸椎后縱韌帶骨化患者的后縱韌帶中LMP-1水平表達(dá)差異，探討LMP-1對(duì)韌帶骨化調(diào)控作用的分子生物學(xué)機(jī)制;
　　2、檢測LMP-1在脊柱韌帶組織中原位分布情況，探討LMP-1在脊柱韌帶骨化病中的發(fā)病機(jī)制。
　　方

4、法:
　　1、標(biāo)本的選取:根據(jù)患者的臨床癥狀、影像學(xué)檢查證明為頸椎后縱韌帶骨化患者16例標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組;以脊髓外傷或術(shù)前影像學(xué)證明非骨化手術(shù)入路切取的頸椎后縱韌帶患者20例標(biāo)本為對(duì)照組。
　　2、應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)組16例OPLL標(biāo)本及對(duì)照組20例非OPLL標(biāo)本行mRNA檢測，每個(gè)標(biāo)本以待測基因與內(nèi)參基因灰度值的比值為計(jì)算參數(shù)，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，兩組數(shù)據(jù)問采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS19

5、.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3、運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)兩者標(biāo)本進(jìn)行染色，以抗LMP-1單抗為一抗，以SABC法為實(shí)驗(yàn)步驟，DAB顯色，顯微鏡下觀察標(biāo)本顆粒有無情況，IPP6.0圖像分析軟件測定Tryptase的表達(dá)。每張切片電鏡下放大200倍，隨機(jī)取3～5個(gè)測量視野，測量后縱韌帶Tryptase平均光密度值(OD)，然后取其平均值。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，兩組數(shù)據(jù)間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPS