頸椎突出椎間盤對(duì)后縱韌帶骨化形成機(jī)制的研究.pdf

1、后縱韌帶骨化癥(ossification of the posterior longitudinal ligament，OPLL)是發(fā)生在脊柱后縱韌帶中的異位骨化，壓迫脊髓和神經(jīng)根而導(dǎo)致其功能受損的一種疾病。其發(fā)病機(jī)制至今不明確。后縱韌帶增厚及骨化與突出的椎間盤是導(dǎo)致頸椎椎管狹窄常見的原因，在臨床上，我們經(jīng)常發(fā)現(xiàn)椎間盤的突出和后縱韌帶的增厚、骨化是同時(shí)存在的，但是兩者之間是否具有相關(guān)性，目前尚未見報(bào)道。
　　目的:
　　本實(shí)

2、驗(yàn)旨在:在體外，研究髓核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)后縱韌帶細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性及成骨分化能力的影響，探討頸椎退變突出的椎間盤對(duì)后縱韌帶骨化(OPLL)發(fā)展的作用，為后縱韌帶骨化癥的診治提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.骨化后縱韌帶細(xì)胞培養(yǎng)及傳代
　　通過影像學(xué)資料（X、CT及MRI）選取后縱韌帶骨化合并頸椎間盤突出的患者10例，通過頸椎前路椎體次全切手術(shù)獲取骨化的后縱韌帶（標(biāo)本采集經(jīng)患者和家屬同意），剔除骨化的部分，保留

3、未骨化的韌帶，用組織塊原代培養(yǎng)法行頸椎后縱韌帶成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)并傳代，收集第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　2.髓核細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代
　　通過影像學(xué)資料（X、CT及MRI）選取頸椎間盤突出的患者1例，通過頸椎前路椎間盤切術(shù)獲取突出的髓核組織（標(biāo)本采集經(jīng)患者和家屬同意），利用酶解法（Ⅱ型膠原酶消化）提取髓核細(xì)胞，行原代培養(yǎng)并傳傳代，收集第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　3.建立實(shí)驗(yàn)分組
　　建立實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，通過Transwe

4、ll建立后縱韌帶細(xì)胞和髓核細(xì)胞共培養(yǎng)體系。實(shí)驗(yàn)組:OPLL細(xì)胞接種于Transwell六孔板下室，髓核細(xì)胞接種與Transwell六孔板上室，中間隔以孔徑為0.4μm的聚酯膜;對(duì)照組:OPLL細(xì)胞種板于普通六孔板。
　　4.酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組于37℃、5％ CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)兩天后，收集實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液，2000rp

5、m離心20分鐘，取上清液于EP管中待測(cè)，按ELISA試劑盒操作方法分別檢測(cè)IL-1α、IL-6、PGE2及TNF-α含量。
　　5.MTT比色法測(cè)細(xì)胞毒性
　　實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組于37℃、5％ CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)兩天后，加入MTT液，繼續(xù)在37℃、5％ CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時(shí)，小心吸去每孔內(nèi)的培養(yǎng)液，加入DMSO，酶標(biāo)儀測(cè)OD490值。
　　6.EdU法測(cè)細(xì)胞增殖
　　實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組于37℃、5

6、％ CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天后，吸除培養(yǎng)液，加入含EdU溶液的培養(yǎng)基（1000∶1的比例稀釋），行EdU標(biāo)記，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。吸除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗3遍，固定液固定細(xì)胞，依次用Apollo染色液及Hoechst染料對(duì)DNA染色。于熒光顯微鏡下鏡檢，計(jì)數(shù)細(xì)胞增殖率（紅色細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)）。
　　7.RT-PCR法檢測(cè)mRNA的表達(dá)
　　使用Trizol提取總RNA;用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反應(yīng)體系將所得RNA轉(zhuǎn)

7、錄成cDNA，此過程分兩步進(jìn)行:首先去除基因組DNA，其次進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng);將cDNA加入PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用2-ΔΔCt值分析mRNA相對(duì)表達(dá)。
　　8.Von Kossa染色法及ALP染色法檢測(cè)成骨活性
　　實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組于37℃、5％ CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，采用ALP染色試劑盒（鈣鈷法），分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組OPLL細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組于37℃、5％ CO2及飽和濕度的培

8、養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，采用Von Kossa染色試劑盒操作方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組染色。
　　9.統(tǒng)計(jì)分析
　　應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用t檢驗(yàn)方法比較組間不同處理的差異，P＜0.05為統(tǒng)計(jì)具有差異性。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞毒性 MTT法檢測(cè)共培養(yǎng)體系對(duì)后縱韌帶細(xì)胞細(xì)胞毒性發(fā)現(xiàn):實(shí)驗(yàn)組OD490均較對(duì)照組OD490高，對(duì)照組OD490值為0.25±0.06，實(shí)驗(yàn)組OD490為0.28±0.09，差

9、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.細(xì)胞增殖熒光顯微鏡下熒光激發(fā)、拍攝及合成圖片示:實(shí)驗(yàn)組中伴有DNA新合成的紅色細(xì)胞核數(shù)明顯多于對(duì)照組，在4小時(shí)內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組中OPLL細(xì)胞增殖率為14.30±2.67％，對(duì)照組中OPLL細(xì)胞增殖率為2.21±0.64％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.Von Kossa染色及ALP染色在Von Kossa染色中，實(shí)驗(yàn)組中有明顯的鈣結(jié)節(jié)沉淀，而對(duì)照組中鈣結(jié)節(jié)沉淀幾乎不可見;AL

10、P染色中，實(shí)驗(yàn)組中染色陽性的細(xì)胞數(shù)明顯較對(duì)照組多。
　　4.RT-PCR檢測(cè)Ⅰ、Ⅺ型膠原及骨鈣素mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中Ⅰ型膠原、Ⅺ型膠原及骨鈣素mRNA的表達(dá)均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.ELISA法測(cè)炎癥因子與OPLL組及NP組相比，OPLL+NP組上清液中IL-1α、TNF-α、PGE2的含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組上清液中IL-6含量低于最低檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)6.25