頸椎后縱韌帶骨化細(xì)胞成骨活性及相關(guān)分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：頸椎后縱韌帶骨化癥(OPLL)是以頸椎韌帶異位骨化為特點(diǎn)的常見脊柱疾患，隨著骨化的進(jìn)展，椎管逐漸狹窄，脊髓和神經(jīng)組織受壓、損傷，可導(dǎo)致不同程度的內(nèi)臟植物神經(jīng)功能紊亂及四肢感覺、運(yùn)動(dòng)障礙等臨床癥狀，甚至完全癱瘓。在亞洲人群中，特別是在年齡超過65歲的老年人群中發(fā)病率較高，可達(dá)20％～34％。OPLL目前保守治療效果差，但外科手術(shù)治療有時(shí)效果不理想，且手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)較大，容易出現(xiàn)頸脊髓損傷等嚴(yán)重并發(fā)癥，因此急需開發(fā)更加安全、有效的藥物或其它

2、治療手段。自從報(bào)道OPLL以來，通過大量基礎(chǔ)和臨床方面研究，發(fā)現(xiàn)基因突變、細(xì)胞因子、激素及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子等與OPLL密切相關(guān)，例如BMPs、IGF等多種細(xì)胞因子及蛋白酶A/C、SMAD、MAPK通路等均在OPLL發(fā)生和發(fā)展過程起到重要作用。雖然這些研究對(duì)頸椎后縱韌帶骨化的病因和發(fā)病機(jī)制有一定詮釋，但仍未能清楚的解釋其確切發(fā)病機(jī)制及發(fā)病機(jī)理，需更進(jìn)一步探索。①OPLL是韌帶組織異位骨化成骨組織，細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是其基本病理過程，因此探討骨化

3、后縱韌帶內(nèi)的成骨相關(guān)細(xì)胞是否具有干細(xì)胞特性有助于進(jìn)一步明確其發(fā)病機(jī)制;②在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)縫隙連接蛋白Connexin43(Cx43)在OPLL韌帶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯高于非OPLL韌帶細(xì)胞，并且初步提示其在OPLL發(fā)生發(fā)展過程中可能起到非常重要的作用。因此，需更深入的研究Cx43功能及其具體作用機(jī)制，闡明其與胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的功能關(guān)系;③近幾年研究發(fā)現(xiàn)與炎癥相關(guān)的NF-κB/p65(p65)是成骨過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn)軟骨的發(fā)生

4、及成骨化，參與并協(xié)調(diào)骨再生過程。但其在頸椎后縱韌帶骨化過程中相關(guān)機(jī)制尚無報(bào)道。因此，進(jìn)一步深入研究p65在OPLL成骨轉(zhuǎn)分化過程中的作用機(jī)制，闡明作用方式，明確OPLL的發(fā)生是否與炎癥因子相關(guān)，不但有助于全面認(rèn)識(shí)OPLL的發(fā)病機(jī)制，又為研究OPLL治療及預(yù)防提供理論基礎(chǔ)和新思路。
　　方法：自2013年12月至2014年8月對(duì)22例頸椎后縱韌帶骨化癥和16例非骨化頸椎病患者行頸椎前路手術(shù)，包括椎間隙減壓融合內(nèi)固定術(shù)或椎體次全切除減

5、壓融合內(nèi)固定術(shù)，術(shù)中收集后縱韌帶組織標(biāo)本，切除過程中盡量減少槍狀咬骨鉗對(duì)所取韌帶、骨化組織的鉗壓，并大塊切除。標(biāo)本分為兩部分:第一部分標(biāo)本切取后PBS緩沖液沖洗并立即多聚甲醛固定，隨后行HE染色和免疫組織化學(xué)染色等組織學(xué)觀察。第二部分標(biāo)本培養(yǎng)韌帶細(xì)胞，利用免疫熒光染色技術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)波狀蛋白染色并鑒定后縱韌帶細(xì)胞，以及進(jìn)行相關(guān)分子生物學(xué)研究。具體如下:取第3代OPLL細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定細(xì)胞膜表面抗原;培養(yǎng)細(xì)胞分別經(jīng)不同誘導(dǎo)液誘導(dǎo)，檢

6、測(cè)成骨活性相關(guān)ALP染色及茜素紅染色、檢測(cè)成脂活性相關(guān)油紅染色及成軟骨活性相關(guān)阿辛藍(lán)染色，應(yīng)用Q-PCR技術(shù)檢測(cè)分化相關(guān)基因（BMP2、Runx2、ALP、PPARγ2、LPL、Sox9、COL2A1、COL10A1)活性。細(xì)胞種植于裸鼠體內(nèi)，并觀察其在體成骨活性。取第3代兩組細(xì)胞，種植于加力板內(nèi)培養(yǎng)，采用Flexercell細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞施加機(jī)械應(yīng)力，對(duì)照組為以同樣條件培養(yǎng)細(xì)胞但未施加機(jī)械應(yīng)力。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT

7、Q-PCR）技術(shù)檢測(cè)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)前后成骨特異性標(biāo)志基因堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型膠原(COLⅠ)、骨鈣素(OCN)及Runx2表達(dá)量的差異;制備Cx43基因干擾RNA(siRNA)序列，采用陽離子轉(zhuǎn)染試劑攜帶siRNA轉(zhuǎn)染兩組細(xì)胞，以阻斷Cx43基因的表達(dá)，并分別以Q-PCR技術(shù)及Western-blotting技術(shù)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率。將骨化、非骨化及轉(zhuǎn)染、非轉(zhuǎn)染細(xì)胞應(yīng)力加載，分別加載0min、15min、30mn、60min及90min五個(gè)

8、時(shí)間點(diǎn)，提取各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞總蛋白，Western-blotting技術(shù)分別檢測(cè)p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK及p-p65蛋白的含量。分別選擇p38MAPK、ERK1/2、JNK及NF-κB/p65通路特異抑制劑選擇合適濃度抑制各通路蛋白磷酸化，應(yīng)力加載48h后分別檢測(cè)ALP、COLⅠ、Runx2及OCN等成骨標(biāo)志物基因的表達(dá)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定(ELI SA)檢測(cè)炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6及TNF-α分泌量。

9、
　　結(jié)果：組織經(jīng)免疫組織化學(xué)染色提示在所切除韌帶標(biāo)本內(nèi)Cx43、p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK、p-p65以及炎性因子IL-13、IL-6、TNF-α均有陽性表達(dá)，OPLL組明顯強(qiáng)于n-OPLL組。以組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)2w左右細(xì)胞可從組織塊中爬出，形狀不規(guī)則，大致呈梭形，排列紊亂。培養(yǎng)3w后細(xì)胞單層狀聚集，圍繞組織塊呈簇狀分布，排列有序，呈多角形及紡錘形。其中骨化與非骨化組細(xì)胞形狀無明顯差別。免疫熒光波狀蛋白染色

10、呈陽性，細(xì)胞形態(tài)好，提示所培養(yǎng)細(xì)胞為后縱韌帶細(xì)胞。胞膜表面抗原CD29、CD105、CD90和CD44陽性，CD34及CD45陰性，與間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)細(xì)胞表面特異標(biāo)志物相符合。經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14天后，可發(fā)現(xiàn)有大量酯滴、鈣化結(jié)節(jié)(28d)及軟骨球形成，ALP染色強(qiáng)陽性;細(xì)胞種植于裸鼠體內(nèi)2月后，可見有鈣鹽沉積，新生骨形成，具有較強(qiáng)成骨能力。Western-blotting檢測(cè)提示連接蛋白Cx43在骨化組細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯強(qiáng)于非骨化組，差

11、異顯著（p＜0.05）。成功構(gòu)建了Cx43的siRNA，分別經(jīng)Q-PCR及Western-blotting檢測(cè)基因及蛋白的抑制效率均大于70％以上。機(jī)械牽張應(yīng)力可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK、ERK1/2、JNK及p65的磷酸化，在應(yīng)力刺激30min或60min時(shí)達(dá)到磷酸化高峰，隨后下降。骨化組磷酸化較非骨化組明顯，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。對(duì)Cx43基因行小RNA干擾后，再以機(jī)械應(yīng)力刺激，各時(shí)間點(diǎn)p38 MAPK、ERK1

12、/2、JNK及p65磷酸化水平明顯減低，與未干擾組相比差異顯著(p＜0.05)。細(xì)胞經(jīng)機(jī)械應(yīng)力刺激后，成骨相關(guān)標(biāo)記物ALP、COLⅠ、OCN及Runx2基因表達(dá)明顯增高，誘導(dǎo)前后相比差異顯著(p＜0.05)。而對(duì)于非骨化組細(xì)胞卻無明顯刺激作用。分別干擾Cx43表達(dá)及以各通路特異抑制劑抑制通路蛋白磷酸化后，再以機(jī)械應(yīng)力刺激48h，ALP、COLⅠ、OCN及Runx2基因表達(dá)較單純機(jī)械應(yīng)力刺激組減弱，差異顯著(p＜0.05)，其中在抑制JN

13、K通路組差異不明顯(p＞0.05)。提示JNK通路在OPLL發(fā)生過程中作用不顯著。ELISA檢測(cè)骨化組細(xì)胞培養(yǎng)液中的炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α在機(jī)械應(yīng)力刺激后明顯增多，與未刺激相比差異顯著(p＜005)。在非骨化組細(xì)胞無明顯作用。干擾Cx43或抑制p65通路可明顯降低機(jī)械應(yīng)力刺激效應(yīng)，IL-1β、IL-6及TNF-α分泌減少，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論：頸椎后縱韌帶細(xì)胞可通過組織塊培養(yǎng)法成功

14、獲得，并以波狀蛋白染色證實(shí)其來源。①細(xì)胞的表面標(biāo)志物及成骨、成脂、成軟骨多向分化及細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成骨能力均提示其符合間充質(zhì)干細(xì)胞特性。②機(jī)械應(yīng)力在頸椎后縱韌帶骨化的病理過程中起到了重要的促進(jìn)作用;③p38 MAPK、ERK1/2及p65通路可能參與了OPLL的骨化發(fā)生和進(jìn)展過程;④Cx43蛋白及其相關(guān)信號(hào)傳遞作用參與了OPLL發(fā)展過程，其中Cx43可能通過p38-MAPK、ERK1/2及p65通路影響骨化過程;⑤通過檢測(cè)標(biāo)本及應(yīng)力刺激后細(xì)