氧自由基對(duì)大鼠小腸上皮細(xì)胞的損傷及硫辛酸的干預(yù)研究.pdf

1、目的：本試驗(yàn)通過體外培養(yǎng)大鼠小腸上皮細(xì)胞(IEC)，建立黃嘌呤氧化酶/黃嘌呤(XO/X)和過氧化氫（H2O2）對(duì)IEC氧化損傷模型，研究不同氧自由基對(duì)小腸上皮細(xì)胞損傷與功能的關(guān)系，以及硫辛酸（LA）對(duì)XO/X與H2O2氧化脅迫下IEC的干預(yù)作用。
　　方法：實(shí)驗(yàn)一：對(duì)原代培養(yǎng)大鼠IEC的分離方法做出改進(jìn)與簡化：聯(lián)合運(yùn)用300 U/mL膠原酶Ⅺ和100 mg/ml中性蛋白酶I分離新生大鼠小腸，可得到完整隱窩單位和少數(shù)單個(gè)小腸上皮細(xì)胞

2、，在5％FBS-DMEM/F12生長培養(yǎng)基中，3-4d形成細(xì)胞集落，7-8d細(xì)胞匯合需要傳代，用0.05%Trypsin-EDTA消化細(xì)胞，傳代后細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，運(yùn)用刮除法和相差消化相差貼壁法進(jìn)行純化，經(jīng)免疫組化法鑒定能夠得到純度80％以上的小腸上皮細(xì)胞，為研究營養(yǎng)素對(duì)腸上皮細(xì)胞的作用提供了理想的體外模型。
　　實(shí)驗(yàn)二：XO/X與H2O2損傷IEC模型的建立：以不同濃度的XO/X（5、10、50、100、200U/L XO和10

3、μmol/L X）和不同濃度的H2O2（0.1μmol/L、1μmol/L、2.5μmol/L、10μmol/L、30μmol/L、100μmol/L和1mmol/LH2O2），分別作用IEC細(xì)胞3、12、24、48h，以四唑鹽(MTT)比色法檢測細(xì)胞活力氧化，確定XO/X和H2O2損傷模型適宜損傷濃度和損傷時(shí)間。
　　實(shí)驗(yàn)三：XO/X和H2O2氧化脅迫模型下大鼠IEC損傷與修復(fù)及LA的干預(yù)作用：XO/X模型下，空白對(duì)照組:細(xì)胞正

4、常培養(yǎng)24h；XO/X損傷組：細(xì)胞中加入50U/L XO，10μmol/L X后，培養(yǎng)24 h；XO/X+LA藥物組：細(xì)胞與不同濃度的LA（0.lμg/ml、1μg/ml和10μg/ml）預(yù)孵3 h，再加入50U/L XO培養(yǎng)24h。H2O2模型下：空白對(duì)照組：細(xì)胞正常培養(yǎng)24h； H2O2損傷組：加入100μmol/L H2O2后，培養(yǎng)24 h； H2O2+LA藥物組：細(xì)胞與不同濃度的LA（0.lμg/ml、1μg/ml和10μg/m

5、l）預(yù)孵3 h，再加入100μmol/L H2O2培養(yǎng)24 h，分別測定LA對(duì)各組細(xì)胞活力，IEC抗氧化指標(biāo)（SOD、GSH-pX和MDA）、功能酶（脂肪酶、淀粉酶）、腸道損傷特異性指標(biāo)（DAO和LDH）的影響。
　　結(jié)果：1. XO/X損傷IEC模型的適宜濃度為50U/L XO和10μmol/L X，適宜培養(yǎng)時(shí)間為24h； H2O2損傷IEC模型的適宜濃度為100μmol/ml H2O2，適宜培養(yǎng)時(shí)間為24h。
　　2.

6、XO/X（50U/L XO/10μmol/L X）與H2O2（100μmol/ml）氧化脅迫下的IEC，細(xì)胞活力顯著下降（P<0.05），IEC的SOD、GSH-pX、脂肪酶、淀粉酶、二胺氧化酶活性顯著下降（P<0.05），細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量顯著上升（P<0.05）；且50U/L XO對(duì)IEC造成的氧化損傷相較100umol/ml的H2O2嚴(yán)重。
　　3. LA可以促進(jìn)IEC的增殖，顯著提高XO/X與H2O2兩種模型氧化脅迫下