一株新Calicheamicins產(chǎn)生株小單孢菌C3509的發(fā)酵、分離純化及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、隨著抗腫瘤“彈頭”藥物的抗體導(dǎo)向治療的研究進(jìn)展，使得一些高效但毒副作用較大的藥物充分發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)避免其毒副作用。高效“彈頭”藥物已成為治療腫瘤的一種利器。本實(shí)驗(yàn)的目的是對(duì)用精原細(xì)胞法篩選到的菌株C—3509發(fā)酵產(chǎn)物分離純化，尋找高效抗腫瘤“彈頭”藥物，并對(duì)其抗腫瘤活性、機(jī)理進(jìn)行研究。 分類培養(yǎng)采用通常有代表性的培養(yǎng)基及國(guó)際鏈霉菌規(guī)劃會(huì)議擬定的培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱ISP培養(yǎng)基)，28℃靜止培養(yǎng)21天，觀察C—3509菌株的培養(yǎng)特征

2、。顏色鑒定參考Ridgwa圖譜；生理生化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法；細(xì)胞壁化學(xué)組份研究參照Backer、Lechevalier和Hasegawa的方法；磷酸類脂、醌類及G+Cmol％的分析按照中國(guó)科學(xué)院微生物所Ross、阮繼生的方法進(jìn)行。根據(jù)理化特征、生理特征及初步的16sDNA對(duì)菌株C—3509分類，其屬于棘孢小單孢菌屬(M．echinospora)。與M．echinospora subsp.Calichensis cheamicins的產(chǎn)生株

3、比較，C—3509在孢子形態(tài)、ISP系列培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征及對(duì)碳源利用的偏好與之不同。此外，在生長(zhǎng)溫度、細(xì)胞壁組成成份上兩者也有所差別。 本文在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了含不同組份的培養(yǎng)基，比較其活性產(chǎn)物的含量。對(duì)活性產(chǎn)物含量高的培養(yǎng)基，用響應(yīng)曲面法(response surface methodology RSM)對(duì)其培養(yǎng)基組份配比進(jìn)行優(yōu)化，首先用部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Fractional Factorial Design FF

4、D)篩選其中影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素(組份)，然后重點(diǎn)考察篩選出的重要因素，用梯度尋優(yōu)法使得因素取值接近最優(yōu)化水平。用響應(yīng)曲面法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后，分別用原發(fā)酵培養(yǎng)基和改進(jìn)的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，重復(fù)兩次，用DNA斷裂法檢測(cè)活性產(chǎn)物的含量，改進(jìn)后的培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)DNA切割能力比初始培養(yǎng)基發(fā)酵液的DNA切割能力強(qiáng)約30倍。 接著用大孔吸附樹脂柱層析、乙酸乙酯萃取、正已烷沉淀、硅膠柱層析、薄層層析、高效液相制備柱層析等方法分離純化活性產(chǎn)

5、物。純化的產(chǎn)物通過(guò)ESI—MS來(lái)確定其分子量，HR—ESI—MS來(lái)確定其分子式。我們根據(jù)上述的純化方法得到粗品3，然后將粗品3用HPLC—MS分析，發(fā)現(xiàn)其中有四種組份組份A、組份B、組份C、組份D分子量分別為1321，1367，1344，1381，分別與已知的化合物calicheamicin γ1Br，calicheamicin γ1I，calicheamicinβ1Br，calicheamicinβ1I分子量相同。對(duì)其中含量高的B組份

6、進(jìn)一步分離，得到純度為87.8％的C—3509B，HR—ESI—MS確定其分子式C55H74N3O21S4I，輔以1H—NMR的分析，基本確定C—3509B是已知的烯二炔類抗腫瘤抗生素calicheamicinγ1I。 用DNA斷裂法、MTT法檢測(cè)了C—3509B的生物學(xué)活性及細(xì)胞毒性。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了不同濃度C—3509B對(duì)人肝細(xì)胞周期阻滯情況。用Western blot檢測(cè)低濃度的C—3509B引起HepG2細(xì)胞周期阻滯的

7、分子學(xué)機(jī)制。DNA斷裂法檢測(cè)C—3509B的最小DNA損傷濃度為0.02μg/ml，MTT法檢測(cè)C—3509B對(duì)多種細(xì)胞有極強(qiáng)的殺傷性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明低濃度C—3509B處理人肝癌細(xì)胞會(huì)引起細(xì)胞周期阻滯，高濃度的C—3509B處理人肝癌細(xì)胞會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的DNA斷裂。Western blot檢測(cè)表明，在C—3509B誘導(dǎo)HepG2周期阻滯中可能與ATM/CHK2信號(hào)通路有關(guān)。 以精原細(xì)胞法篩選到的小單孢菌菌株C—3509為出發(fā)

8、菌，通過(guò)對(duì)其發(fā)酵條件的優(yōu)化提高活性物質(zhì)在發(fā)酵液中的含量，分離純化出C—3509B。經(jīng)過(guò)ESI—MS，HR—ESI—MS，UV和DNA斷裂活性分析，推斷C—3509B為Calicheamicinγ1I。本文對(duì)菌株C—3509分類研究表明，其是一株不同于M．echinospora subsp.Calichensis的棘孢小單孢菌。不同濃度的抗生素C—3509B對(duì)細(xì)胞有不同的損傷作用，低濃度的C—3509B會(huì)引起細(xì)胞G2/M期阻滯。C—350