原兒茶酸影響動物腸道屏障功能的研究.pdf

1、原兒茶酸（PCA，3，4-二羥基苯甲酸）廣泛分布于許多植物及中國傳統(tǒng)藥材中，如冬青，烏蕨等等。PCA的抗氧化、抗菌、抗病毒和抗炎功能及其在抗癌、抗?jié)儭⒖固悄虿?、抗老化和抗纖維中的應(yīng)用已得到廣泛研究。本研究在體外探究了PCA對四株不同細(xì)菌的抑制及殺菌作用基礎(chǔ)上，研究了PCA對小鼠腸道屏障功能的調(diào)節(jié)作用，及其抗鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium）感染的機(jī)制。此外，體外實驗研究了PCA對小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞免疫功能的影響及機(jī)

2、理。最后，探究了PCA對黃羽肉雞的生長性能、肉質(zhì)和腸道屏障的影響。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.PCA對主要病原菌的抑菌效果
　　體外抑菌實驗表明，PCA對鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Cl.perfringens）、大腸桿菌(E.coli)及金黃色葡萄球菌（S.aureus）均有抑制作用，并且高濃度的PCA（超過2mg/mL）對細(xì)菌生長有長時間抑制作用，且對這四株菌有很強(qiáng)的殺菌能力。從毒素基因表達(dá)看，PCA顯著下調(diào)了S

3、.typhimurium菌InvA、SopD、SipB、HilA和SsrB的表達(dá)，表明PCA可通過體外調(diào)節(jié)毒力因子的表達(dá)來抑制細(xì)菌生長，并且PCA抑菌和殺菌的機(jī)制不同于慶大霉素(Gentamicin，GM)。以上結(jié)果表明，PCA可有效抑制和殺滅鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌，并且可通過體外調(diào)節(jié)毒力因子的表達(dá)來抑制沙門氏菌。
　　2.PCA對小鼠腸道屏障功能的調(diào)節(jié)作用及抗沙門氏菌感染的能力
　　分別對小

4、鼠飲水給藥PCA（50mg/kg/天）、GM（80mg/kg/天），并設(shè)置對照組，飼喂周期為28天。結(jié)果表明，與對照組相比，小鼠口服PCA可明顯增加體重;對肝臟、脾臟、結(jié)腸、回腸的結(jié)構(gòu)無不良影響;顯著增加了肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù);使小鼠回腸與結(jié)腸中NO和sIgA含量略有增加;顯著提高結(jié)腸屏障相關(guān)蛋白的基因表達(dá)。菌群分析表明，PCA并未影響菌群的β多樣性，但可顯著提高厚壁菌門（Fimicutes）的相對豐度，降低擬桿菌門（Bacteroide

5、tes）的相對豐度;PCA處理后，厚壁菌門（門水平）、乳桿菌（目到屬水平）、脫硫弧菌（綱到屬水平）等為優(yōu)勢菌。以上結(jié)果表明，50mg/kg/天PCA對小鼠安全性良好，并且可以改善小鼠腸道菌群，增強(qiáng)腸粘膜屏障及機(jī)體免疫功能。
　　上述飲水給藥28天后的實驗小鼠，分別灌胃S.typhimurium(4×108CFU/只)進(jìn)行攻毒。結(jié)果表明，與沙門氏菌感染小鼠相比，PCA預(yù)處理可以顯著降低小鼠的死亡及體重?fù)p失;顯著降低沙門氏菌在回腸、結(jié)

6、腸、盲腸的定植，顯著改善結(jié)腸和回腸病變及腸絨毛脫落、斷裂等情況;顯著上調(diào)結(jié)腸中屏障蛋白的基因表達(dá);顯著降低血清、結(jié)腸內(nèi)炎性細(xì)胞因子如IFN-γ，IL-12，TNF-α的增加;并可降低肝臟、MLN內(nèi)炎性細(xì)胞因子的表達(dá);顯著改善血清及腸道中抗體IgG、sIgA的急劇增加;顯著并且降低其向肝臟、脾臟的轉(zhuǎn)移;降低脾臟和肝臟腫大，下調(diào)肝臟caspase-1活性，抑制肝細(xì)胞凋亡。同時，PCA可以顯著提高沙門氏菌感染小鼠腸道中厚壁菌門(Fimicut

7、es)的相對豐度，降低擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度;厚壁菌門（門水平），脫硫弧菌（綱到屬水平）等為優(yōu)勢菌?？山档蜕抽T氏菌毒力基因InvA、SopD、SipB、SsrB和HilA在盲腸內(nèi)容物中的豐度。綜上，PCA可以通過改善感染小鼠腸道免疫功能、緊密連接和腸道菌群組成來抑制沙門氏菌在腸道中的定植及其向各組織器官的轉(zhuǎn)移，從而抑制沙門氏菌感染造成的多器官損傷及全身性炎癥反應(yīng)。
　　3.PCA對小鼠RAW264.7巨噬

8、細(xì)胞免疫功能的影響
　　分別采用1～500μg/mL PCA處理RAW264.7細(xì)胞系，CCK-8和胞外LDH測定發(fā)現(xiàn)100μg/mL及以下濃度PCA對RAW264.7細(xì)胞為安全濃度;5～100μg/mL的PCA均可提高RAW264.7的ACP活性，其中25μg/mL PCA處理時，ACP活性提高最多，后續(xù)使用該濃度進(jìn)行探究。PCA可有效提高RAW264.7胞內(nèi)LDH的活性;上調(diào)RAW264.7標(biāo)志分子CDS0、CD86、MHCⅡ

9、的表達(dá)，表明PCA可激活小鼠RAW264.7細(xì)胞;PCA可提高RAW264.7的tNOS活性和NO含量;上調(diào)促炎及抑炎因子的基因表達(dá)，下調(diào)M2極化相關(guān)基因MR、Fizz1的基因表達(dá);增加IL-1、IL-6、IL-12和TGF-β的分泌。PCA處理可以顯著提高RAW264.7細(xì)胞吞噬葡聚糖、沙門氏菌和大腸桿菌的能力及殺滅大腸桿菌的能力。以上結(jié)果表明，PCA能夠調(diào)節(jié)RAW264.7的免疫功能，促進(jìn)M1極化、抑制M2型極化來提高其抵抗病原菌感

10、染的能力;
　　4.PCA對黃羽肉雞的生長性能、肉質(zhì)及腸道屏障功能的影響
　　分別對黃羽肉雞飼喂300mg/kg/天和600mg/kg/天PCA，實驗為期52天，同時設(shè)置空白對照及抗生素對照組（恩拉霉素，200mg/kg/天）實驗表明，300mg/kg/天的PCA可顯著提高肉雞末重，并且降低料重比;提高肉雞活重及胴體重;并提高肉雞胸肌L值（亮度）和a值（紅度），降低b值（黃度），改善肉質(zhì);可顯著減少血漿中AKP和DAO活性;

11、提高腸道中總超氧化力、GST-ST及GSH-Px的活性;減少肝臟中MDA含量，并提高肝臟總抗氧化力;顯著增加血漿和空腸腸粘膜中IL-10、TGF-β的含量，并降低IL-2和IFN-γ;降低肝臟中凋亡相關(guān)基因的相對表達(dá)，提高腸道屏障基因的表達(dá)。同時，菌群分析表明PCA增加盲腸菌群的α多樣性，并顯著提高厚壁菌門（Fimicutes）的相對豐度，降低擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度。以