腹腔穿刺引流對重癥急性胰腺炎腸道細(xì)菌移位及屏障功能影響的研究.pdf

1、目的:
　　重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)是臨床上常見的急腹癥，其發(fā)病急，進展快，并發(fā)癥多，預(yù)后差，死亡率高達(dá)15-30％。以往的研究表明，腸道屏障功能損傷在SAP疾病進展中扮演著重要角色。腸道屏障功能損傷可導(dǎo)致細(xì)菌及內(nèi)毒素移位進入血液及淋巴循環(huán)，進而造成胰腺組織繼發(fā)感染及多器官功能衰竭(Multiple Organ Failure，MOF)。因此，保護腸道屏障功能已經(jīng)成為臨床治療SA

2、P的一種重要的治療措施。然而，目前其主要治療方法如早期腸內(nèi)營養(yǎng)、應(yīng)用益生菌及抗生素等效果均不理想，因此，尋找一種有效的治療策略成為臨床上亟待解決的問題。
　　眾所周知，SAP發(fā)生時可產(chǎn)生胰腺炎相關(guān)性腹水(Pancreatitis Associated Ascitic Fluid,PAAF)，業(yè)已證實PAAF含大量的炎性介質(zhì)如細(xì)胞因子、胰酶等，可損傷腸粘膜屏障功能，對SAP病情的發(fā)展起著推動作用。因此，認(rèn)為尚若盡早干預(yù)PAAF這一環(huán)

3、節(jié)，可能對SAP患者的病情及預(yù)后有改善作用。基于此，團隊針對SAP患者早期行腹腔穿刺引流(Abdominal Paracentesis Drainage，APD)治療引流出腹腔內(nèi)PAAF，通過回顧性分析大量臨床病例資料，表明該策略不但可明顯改善胰腺炎患者病情及預(yù)后，還降低了SAP患者死亡率。隨后，通過動物實驗，我們進一步證實了APD不但可明顯提高SAP大鼠生存率，而且對SAP相關(guān)性肺損傷及脂質(zhì)代謝紊亂均有改善作用[8-10]。雖然基于A

4、PD策略的SAP治療取得了這些進展，然而針對其發(fā)揮的有效作用及機制的認(rèn)識還比較初步，尚需進一步研究。例如，APD對腸道細(xì)菌移位是否有作用？APD對腸屏障功能損傷是否會發(fā)揮有益的作用？
　　基于以上分析，本研究擬通過綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)標(biāo)記的大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)，觀察APD對SAP大鼠腸道細(xì)菌移位的作用規(guī)律;然后，通過組織學(xué)、Elisa和免疫

5、組織化學(xué)方法研究APD對SAP大鼠腸屏障功能損傷的作用。
　　方法:
　　1.模型制備:首先使用抗生素對將SD大鼠進行腸道準(zhǔn)備，之后連續(xù)3天喂養(yǎng)質(zhì)粒標(biāo)記有GFP的E.coli(E.coli marked with Green Fluorescent Protein，GFP-E.coli)。待其成功定植于大鼠腸道后，將大鼠分為假手術(shù)(Sham operation，Sham)組、SAP組和APD組，每組30只。胰膽管注射牛磺膽酸

6、鈉制備SAP大鼠模型。術(shù)中右下腹留置腹腔引流管法為APD。假手術(shù)組僅開腹后翻動胰腺數(shù)次后即關(guān)腹。
　　2.胰腺炎死亡率及嚴(yán)重程度的觀察與檢測:24小時后觀察三組大鼠死亡率、腹水量，并在無菌條件下手術(shù)取材并處死大鼠。蘇木素和伊紅(Hematoxylin And Eosin，HE)染色法對三組大鼠胰腺組織進行病理學(xué)評分;ELISA法測定血清C反應(yīng)蛋白(C-reaction protein，CRP)、腫瘤壞死因子(Tumor Necro

7、sis Factor-α，TNF-α)及白細(xì)胞介素β（Interleukin-1β，IL-1β）水平，血清內(nèi)毒素水平。
　　3.細(xì)菌移位情況檢測:血液、腸系膜淋巴結(jié)(Mesenteric Lymph Node，MLN)及胰腺組織經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)后，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)菌移位程度并計算細(xì)菌移位率。
　　4.腸屏障功能的檢測:HE染色法對三組大鼠小腸組織進行病理學(xué)評分，ELISA法測定血清(intestinal Fatty Acid

8、Binding Protein，iFABP)、二胺氧化酶(Diamine Oxidase，DAO)及D-乳酸水平，免疫組織化學(xué)法檢測小腸粘膜緊密連接蛋白閉鎖小帶(Zona Occludens，ZO-1)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.胰腺炎嚴(yán)重程度:1.1死亡率與腹水Sham組大鼠未見死亡，APD組大鼠死亡率明顯低于SAP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。Sham組大鼠未見腹水，APD組大鼠腹水量明顯少于SAP組，差異

9、有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。1.2胰腺組織病理學(xué)評分與Sham組比較，SAP組、APD組胰腺組織病理學(xué)評分明顯升高(p＜0.05);與SAP組比較，APD組胰腺組織病理學(xué)評分明顯降低(p＜0.05)。1.3血清CRP、TNF-α及IL-1β水平與Sham組比較，SAP組及APD組血清CRP、TNF-α、IL-1β水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);與SAP組比較，APD組血清CRP、TNF-α、IL-1β水平明顯降低，差異

10、有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　2.細(xì)菌移位情況:2.1細(xì)菌移位Sham組大鼠血液、MLN及胰腺組織均未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌移位，Sham組、SAP組及APD組血液均未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌移位;SAP組和APD組MLN和胰腺組織出現(xiàn)細(xì)菌移位，而APD組明顯低于SAP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。2.2內(nèi)毒素移位與Sham組比較，SAP組及APD組血清內(nèi)毒素水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);與SAP組比較，APD組血清內(nèi)毒素水平明

11、顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)
　　3.腸屏障功能情況:3.1小腸組織病理學(xué)評分與Sham組比較，SAP組、APD組小腸組織病理學(xué)評分明顯升高(p＜0.05);與SAP組比較，APD組小腸組織病理學(xué)評分明顯降低(p＜0.05)。3.2血清i-FABP、DAO及D-乳酸水平與Sham組比較，SAP組及APD組血清i-FABP、DAO及D-乳酸水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);與SAP組比較，APD組血清i-F

12、ABP、DAO及D-乳酸水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。3.3小腸粘膜緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)情況與Sham組比較，SAP組及APD組緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);與SAP組比較，APD組緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.APD明顯降低了SAP炎癥反應(yīng)和死亡率。
　　2.APD顯著改善了腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素移位。