新型多聚體微泡攜帶藥物舒尼替尼靶向治療腎細(xì)胞癌的離體和在體實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：化療是腫瘤治療的一個(gè)重要手段。但目前絕大多數(shù)化療藥物在發(fā)揮抑瘤作用的同時(shí)會(huì)引起機(jī)體嚴(yán)重的副作用,因而影響其最終療效。如何選擇合適的化療藥物及給藥方式,使其在體內(nèi)最大程度的發(fā)揮藥理作用并盡量減少并發(fā)癥一直是醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。近些年發(fā)展起來(lái)的超聲介導(dǎo)的藥物靶向運(yùn)輸治療腫瘤已成為研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研制新型多聚體超聲微泡作為藥物載體,攜帶抗腎癌藥物舒尼替尼形成新型多聚體微泡-藥物復(fù)合體,評(píng)估離體實(shí)驗(yàn)中其在超聲輻照的作用下對(duì)人腎癌GR

2、C-1細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡效應(yīng),并初步探索將其應(yīng)用于在體腎癌靶向治療的可行性和有效性。
　　方法：制備攜帶有藥物舒尼替尼的新型多聚體微泡,將表面活性劑Span60、Tween80以及不同聚合度的PEG溶于PBS中,向溶液內(nèi)通入SF6氣體,應(yīng)用高強(qiáng)度超聲處理得到超聲微泡,同時(shí)利用跨膜銨梯度法制備得到包含有藥物舒尼替尼的脂質(zhì)體,將超聲微泡和載藥脂質(zhì)體直接混合得到新型多聚體微泡-藥物復(fù)合體。采用庫(kù)爾特粒度儀檢測(cè)微泡及脂質(zhì)體的粒徑分布

3、,通過(guò)Photoshop軟件進(jìn)行圖像分析評(píng)估微泡濃度,通過(guò)吸光度檢測(cè)計(jì)算脂質(zhì)體對(duì)藥物舒尼替尼的包封率。應(yīng)用熒光膽固醇25-NBD-Cholesterol制備帶有熒光的脂質(zhì)體,與微泡連接后在熒光顯微下觀(guān)察,證實(shí)脂質(zhì)體在微泡表面的有效粘附。通過(guò)觀(guān)測(cè)流式細(xì)胞儀檢測(cè)中吸收曲線(xiàn)的變化,驗(yàn)證新型多聚體微泡-藥物復(fù)合體中藥物舒尼替尼的有效加載。離體實(shí)驗(yàn)中,將體外培養(yǎng)的人腎癌GRC-1細(xì)胞隨機(jī)分為6組:空白對(duì)照組(Control)、單純微泡組(MB)、

4、單純脂質(zhì)體組(Lipsome)、舒尼替尼組(Sunitinib)、加載有舒尼替尼的新型多聚體微泡不聯(lián)合超聲組(pMBS-US)和加載有舒尼替尼的新型多聚體微泡聯(lián)合超聲組(pMBS+US)。通過(guò)改變各實(shí)驗(yàn)組不同的藥物濃度和作用時(shí)間,應(yīng)用MTT法觀(guān)察不同處理組的細(xì)胞生存率,應(yīng)用Caspase-3抗體與FITC熒光共同染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,應(yīng)用DAPI熒光染色法觀(guān)察凋亡細(xì)胞的核變化,同時(shí)應(yīng)用透射電子顯微鏡觀(guān)測(cè)凋亡細(xì)胞微結(jié)構(gòu)的變化。在體實(shí)驗(yàn)中,采

5、用引瘤后原代細(xì)胞培養(yǎng)注射細(xì)胞懸液法建立裸鼠RCC皮下移植瘤模型,并隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Control)、多聚體微泡組(pMB)、單純舒尼替尼治療組(Sunitinib)和加載有舒尼替尼的新型多聚體微泡聯(lián)合超聲治療組(pMBS+US)共4組。采用體內(nèi)循環(huán)體外抽檢的方法進(jìn)行新型多聚體微泡-藥物復(fù)合體在體循環(huán)穩(wěn)定性的檢測(cè),應(yīng)用超聲儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)變化并描繪腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn),同時(shí)應(yīng)用Micro-CT檢測(cè)評(píng)估腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移情況,隨時(shí)觀(guān)

6、察記錄藥物舒尼替尼相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生。
　　結(jié)果：新型多聚體超聲微泡的平均直徑為3.17μm,濃度為3×109/mL,含藥脂質(zhì)體的平均粒徑為165nm,其對(duì)舒尼替尼的包封率約為78％。熒光顯微鏡下脂質(zhì)體有效粘附在微泡表面。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,藥物舒尼替尼成功加載于新型多聚體微泡-藥物復(fù)合體中。離體實(shí)驗(yàn)中,結(jié)果顯示載藥新型微泡復(fù)合物對(duì)人腎癌GRC-1細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制及促進(jìn)凋亡作用,其中,pMBS+US組對(duì)該腫瘤細(xì)胞的增殖抑制及誘

7、導(dǎo)凋亡作用強(qiáng)于其他處理組及對(duì)照組,且抑制程度隨作用時(shí)間的增長(zhǎng)和作用藥物濃度的增加而增加。在體實(shí)驗(yàn)中,結(jié)果顯示載藥新型微泡復(fù)合物對(duì)裸鼠RCC有明顯的生長(zhǎng)抑制作用,其中,pMBS+US組對(duì)該腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用與其余各組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,甚至優(yōu)于單純使用藥物治療。以上體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng),具有前后一致性。
　　結(jié)論：無(wú)論是體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn),最有效的RCC治療方案都需要新型多聚體載藥微泡、有效的藥物舒尼替尼及超聲的定點(diǎn)照