骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合瑞舒伐他汀治療大鼠冠狀動(dòng)脈微栓塞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、冠脈微栓塞(Coronarymicroembolization，CME)是急性冠脈綜合征及冠脈介入治療中常見的事件，CME的發(fā)生意味著患者不良的預(yù)后和更高的死亡率，目前未有理想的治療方法[2]。本研究利用注射自體微血栓法復(fù)制大鼠CME模型，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)移植聯(lián)合瑞舒伐他汀治療CME的效果及可能的機(jī)制，為臨床有效的治療CME提供新思路及理論依據(jù)。 一

2、、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)與鑒定 目的：建立穩(wěn)定的體外分離、擴(kuò)增和純化技術(shù)體系以獲取足夠多的大鼠BMSCs，為后序的移植治療奠定良好的基礎(chǔ)。 方法：分離幼年大鼠骨髓，采用貼壁法培養(yǎng)擴(kuò)增BMSCs；對(duì)連續(xù)傳代的第一(P1)、第三(P3)、第五代(P5)BMSCs進(jìn)行絕對(duì)計(jì)數(shù)并描繪生長(zhǎng)曲線；收集P3BMSCs進(jìn)行流氏細(xì)胞儀檢測(cè)及體外成脂、成骨分化鑒定。 結(jié)果：從P1至P5，BMSCs增殖活力呈遞減趨勢(shì)，傳至

3、P3時(shí)即可得到活力強(qiáng)、純度高的BMSCs；大鼠BMSCs基本表達(dá)CD44、CD90，不表達(dá)CD11b、CD34、CD45，并在體外誘導(dǎo)下能分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞。 結(jié)論：通過全骨髓貼壁分離法可以獲取活力強(qiáng)、純度高的大鼠BMSCS。 二、單純骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠冠脈微栓塞的影響 目的：利用帶綠熒光蛋白(greenflorescentprotein，GFP)的慢病毒pGCFU-GFP-LV感染BMSCs，在注射自

4、體微血栓法復(fù)制大鼠CME模型的基礎(chǔ)上，觀察單純BMSCs移植治療大鼠CME的效果及機(jī)制。 方法：以攜帶GFP的pGCFU-GFP-LV慢病毒為媒介，以復(fù)感染指數(shù)(MOI)2、8、32的病毒感染P1BMSCs，倒置相差熒光顯微鏡觀察GFP陽(yáng)性細(xì)胞的感染率，確定最佳感染條件，按最佳MOI值大規(guī)模感染P1BMSCs，傳至P3以備移植用；采用注射自體微血栓法復(fù)制大鼠CME模型，64只清潔級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、CME組、BMS

5、Cs低數(shù)量組和BMSCs高數(shù)量組，低數(shù)量組移植的細(xì)胞數(shù)為2×105，高數(shù)量組為2×106，每組根據(jù)不同觀察時(shí)間點(diǎn)再分為術(shù)后3天、7天、28天分為3個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只：以酶聯(lián)免疫法(ELISA)及免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腫瘤壞死因子a(TNF-a)、白介素1β(IL-1β)、白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)的表達(dá)，多重免疫熒光染色技術(shù)觀察移植細(xì)胞存活情況、評(píng)價(jià)移植細(xì)胞分化，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及蛋白電泳(West

6、ernblot)法檢測(cè)心肌組織血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)mRNA及蛋白表達(dá)，免疫組織化學(xué)Ⅷ因子染色評(píng)價(jià)細(xì)胞移植后毛細(xì)血管生成，伊紅-蘇木素(HE)染色評(píng)價(jià)細(xì)胞移植后心肌病理變化，麥松(Masson)染色檢測(cè)細(xì)胞移植后心肌膠原纖維含量變化，超聲心動(dòng)圖觀察心功能改變。 結(jié)果：以MOI值為8的病毒感染大鼠P1BMSCs四天后，細(xì)胞均基本表達(dá)GFP，且傳至P3未有明顯變化。CME后早期心肌細(xì)胞表達(dá)炎

7、癥因子TNF-a、IL-1β明顯增加；HE染色顯示心肌內(nèi)多中心壞死灶形成，伴明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，多分布于心內(nèi)膜下；Masson染色顯示大量膠原纖維增生；心臟超聲檢測(cè)顯示CME后，左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、收縮末期內(nèi)徑(LVESD)漸進(jìn)擴(kuò)大，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)維持于低水平，上述結(jié)果符合CME的病理改變。移植后28天，無論BMSCs低數(shù)量組還是高數(shù)量組都幾乎難以見到存活的移植細(xì)胞；與CME組比較，無論

8、BMSCs低數(shù)量組還是高數(shù)量組心肌組織TNF-a、IL-1β、IL-4、IL-10及VEGF、bFGF的表達(dá)，均無明顯差異(P>0.05)，微梗死區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和瘢痕化也未見減輕：與CME組比較，BMSCs低數(shù)量組和高數(shù)量組毛細(xì)血管密度均未見增加(P>0.05)，心功能指標(biāo)也未見明顯改善(P>0.05)。 結(jié)論：CME后早期心肌局部的炎癥微環(huán)境可能不利于干細(xì)胞的存活，單純BMSCs移植治療在植入早期可能就有大量的移植細(xì)胞死亡，最

9、終無法減輕CME后心臟重塑，改善心功能。 三.瑞舒伐他汀干預(yù)對(duì)大鼠冠脈冠脈微栓塞后炎癥反應(yīng)的影響 目的：探討瑞舒伐他汀干預(yù)對(duì)CME后早期炎癥因子表達(dá)及心功能的影響，明確瑞舒伐他汀抑制CME炎癥反應(yīng)的有效劑量，為下一步BMSC移植聯(lián)合瑞舒伐他汀治療大鼠CME奠定基礎(chǔ)。 方法：48只清潔級(jí)雄性SD大鼠均分為假手術(shù)組、CME組、瑞舒伐他汀小劑量組(0.5mg/kg.d)和瑞舒伐他汀大劑量組(3.0mg/kg.d)，每組

10、12只，每組根據(jù)不同觀察時(shí)間點(diǎn)再分為術(shù)后3天、28天分為2個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只，瑞舒伐他汀干預(yù)的時(shí)間從術(shù)前7天到術(shù)后7天；以ELISA法及免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)心肌細(xì)胞炎癥因子TNF-a、IL-1β、IL-4、IL-10的表達(dá)，HE染色評(píng)價(jià)心肌組織病理變化，Masson染色檢測(cè)心肌組織膠原纖維含量變化，超聲心動(dòng)圖觀察心功能改變。 結(jié)果：與CME組比較，瑞舒伐他汀低劑量組心肌組織TNF-a、IL-1β、IL-4、IL-10的表達(dá)無明

11、顯差異(P>0.05)，而高劑量組TNF-a、IL-1β表達(dá)降低(P<0.05)，IL-10表達(dá)有所升高(P<0.05)；HE染色顯示瑞舒伐他汀低劑量組心肌組織病理學(xué)改變與CME相似，而高劑量組心肌組織微梗死灶數(shù)量有所減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度也減輕；瑞舒伐他汀高劑量組能減少心肌膠原纖維增生，降低LVESD、LVEDD(P<0.05)，增加LVEF、LVFS(P<0.05)，而低劑量組則不能。 結(jié)論：高劑量(3.0mg/kg.d)瑞

12、舒伐他汀能一定程度上抑制CME后心肌局部炎癥反應(yīng)，減輕心臟重塑，改善心功能。 四.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合瑞舒伐他汀干預(yù)對(duì)大鼠冠脈微栓塞的影響目的：探討B(tài)MSCs移植聯(lián)合瑞舒伐他汀治療CME是否能在減輕CME后心肌局部炎癥反應(yīng)基礎(chǔ)上，更有利于移植的BMSCs存活，產(chǎn)生疊加的治療效果；以及上述治療效果可能的機(jī)制。 方法：90只清潔級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、CME組、BMSCs組、瑞舒伐他汀組和BMSCs+瑞舒伐他汀

13、組，BMSCs移植的細(xì)胞數(shù)為2×105，瑞舒伐他汀干預(yù)的劑量為3.0mg/kg.d，干預(yù)的時(shí)間從術(shù)前7天到術(shù)后7天；每組根據(jù)不同觀察時(shí)間點(diǎn)再分為術(shù)后3天、7天、28天分為3個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只；以ELISA法及免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)心肌細(xì)胞TNF-a、IL-1β、IL-4、IL-10的表達(dá)，多重免疫熒光染色技術(shù)觀察移植細(xì)胞存活情況、評(píng)價(jià)移植細(xì)胞分化，RT-PCR及Westernblot法檢測(cè)心肌組織VEGF、bFGFmRNA及蛋白表達(dá)，免

14、疫組織化學(xué)Ⅷ因子染色評(píng)價(jià)細(xì)胞移植后毛細(xì)血管生成，HE染色評(píng)價(jià)細(xì)胞移植后心肌病理變化，Masson染色檢測(cè)細(xì)胞移植后心肌膠原纖維含量變化，超聲心動(dòng)圖觀察心功能改變。 結(jié)果：與瑞舒伐他汀組比較，BMSCs+瑞舒伐他汀組心肌組織TNF-a、IL-1β表達(dá)進(jìn)一步減少(P<0.05)，IL-10表達(dá)增多(P<0.05)；移植后28天，BMSCs+瑞舒伐他汀聯(lián)合組存活的細(xì)胞數(shù)明顯增多，約是BMSCs組的45倍，除少許移植細(xì)胞與宿主心肌細(xì)胞融

15、合外未見明顯分化為心肌樣的細(xì)胞；與BMSCs組比較，BMSCs+瑞舒伐他汀組心肌組織VEGF、bFGF表達(dá)明顯增多(P<0.05)；與瑞舒伐他汀組比較，微梗死區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和瘢痕化也進(jìn)一步減輕，毛細(xì)血管密度增加(P<0.05)，心功能指標(biāo)顯示，BMSCs+瑞舒伐他汀組LVESD、LVEDD更小(P<0.05)，LVEF、LVFS進(jìn)一步改善(P<0.05)。 結(jié)論：BMSCs移植聯(lián)合瑞舒伐他汀能在瑞舒伐他汀基礎(chǔ)上進(jìn)一步抑制CME后