大鼠口腔黏膜移植模型的建立及其免疫病理學(xué)特征的初步研究.pdf

1、研究背景:
　　 口腔黏膜是機體黏膜免疫體系的重要組成部分之一。作為呼吸道、消化道黏膜的共同始端,口腔黏膜是機體免疫防御的第一道防線。外傷、頜面部炎癥、腫瘤等容易導(dǎo)致口腔黏膜的缺損?？谇火つひ浦彩切迯?fù)大面積口腔黏膜缺損有效的方法之一。但有關(guān)口腔黏膜移植的研究罕見報道,分析因為主要由以下幾點:口腔黏膜組織薄弱且張力大,原位縫合困難；容易被口腔微生物感染；往往涉及復(fù)合組織移植,操作難度大等?，F(xiàn)有研究多以裸鼠作為口腔黏膜移植的受體,但

2、免疫力存在缺陷的裸鼠不能反映免疫力正常正常動物的真實病理特征及過程；部分牙周病治療采用自體牙齦冠向移植來修復(fù)附著喪失或牙齦萎縮,該方法屬于同源移植,其病理過程通常不涉及免疫排斥。缺乏合適的動物模型已經(jīng)成為口腔黏膜移植相關(guān)研究的主要瓶頸。因此,有必要建立一個適用于進行口腔黏膜移植免疫病理學(xué)研究的動物模型。
　　 現(xiàn)有研究認為,組織移植與器官移植在免疫排斥的表現(xiàn)、機制及組織病理學(xué)特點等方面均有明顯不同,此外組織移植的免疫病理學(xué)特征也

3、因部位不同而差別顯著。因此,其它器官或組織移植的研究方法、研究結(jié)果只能被參考而不能直接用于口腔黏膜移植。作為組織移植的一種,口腔黏膜移植的相關(guān)研究嚴重滯后于其它器官或組織移植。主要反映在兩方面:其一,迄今口腔黏膜移植基本的病理學(xué)特征、病理分級標準與分期情況等尚未完全明了；其二,口腔黏膜移植后的免疫學(xué)特征及機制研究尚未見報道。移植免疫本質(zhì)上也是一種炎癥反應(yīng),移植后浸潤細胞及分泌細胞因子的種類、數(shù)量是決定機體或組織局部移植炎癥反應(yīng)是否發(fā)生、

4、發(fā)生強度以及有何特點的關(guān)鍵因素。細胞與細胞因子間的相互作用還是移植炎癥反應(yīng)主要的調(diào)控因素。采用常規(guī)方法很難全面了解過程復(fù)雜、參與成分多樣的移植炎癥反應(yīng)特征,因此如何高效全面地進行上述免疫學(xué)分析是另外一個影響口腔黏膜移植研究的難題和瓶頸。生物芯片技術(shù)已經(jīng)成為高通量分析生物系統(tǒng)性能最重要的平臺之一。目前,該技術(shù)已被廣泛用于包括唾液診斷學(xué)、口腔微生物的致病基因篩選、口腔鱗癌標記物與相關(guān)基因篩選、口腔扁平苔蘚相關(guān)基因篩選等口腔疾病的多個研究領(lǐng)域

5、。第二代功能基因組芯片,又稱PCR芯片,可根據(jù)研究目的將百余個功能相關(guān)基因(如炎癥相關(guān)基因組、通路相關(guān)基因組等)集合在同一張芯片上,在一次反應(yīng)中完成所有基因的熒光定量PCR檢測。與傳統(tǒng)基因芯片相比,其的優(yōu)點體現(xiàn)在針對性強、可以直接使用無需驗證、準確率高等方面。PCR芯片的特有優(yōu)勢將為全面分析口腔黏膜炎癥的免疫特征及機制提供可能。
　　 第一章大鼠口腔黏膜異種異體移植模型的建立與觀察
　　 1.研究目的:
　　 以

6、建立的口腔黏膜移植模型為研究工具,明確口腔黏膜移植的主要病理學(xué)特征并以此為基礎(chǔ)提出口腔黏膜移植的病理學(xué)分級標準,據(jù)此標準對口腔黏膜移植反應(yīng)進行病理分級。
　　 2.研究方法:
　　 (1)實驗動物及分組
　　 將200只Wistar大鼠按照按照處理方式不同分為以下三組:
　　 移植組(Xenograft,X組):將Balb/C小鼠的舌組織移植到Wistar大鼠左側(cè)頰黏膜下,其右側(cè)頰黏膜不做處理(n=80)

7、；
　　 創(chuàng)傷組(Trauma,T組):對Wistar大鼠左側(cè)頰黏膜進行與X組相同的創(chuàng)傷及縫合但不移植組織,其右側(cè)頰黏膜不做處理(n=80)；
　　 正常對照組(Normal,N組):雙側(cè)頰黏膜均不做任何處理(n=40)。
　　 (2)取材時點:
　　 在術(shù)后1天(D1)、D3、D7、D10、D15、D21、D30、D48、D72及D90共10個時點處死動物并取材(D1組只用于組織學(xué)觀察)。每時點隨機選取

8、X組6只、T組6只,N組4只。
　　 (3)大體觀察與測量
　　 觀察指標包括:大鼠48天生存率(Survival rate,SR=存活大鼠數(shù)目/參與實驗大鼠總數(shù))；體重變化百分比(Percent body weight changes,PBW=術(shù)后觀察當日體重/手術(shù)前初始體重×100％)；頰黏膜的腫脹和滲出情況；淋巴結(jié)指數(shù)(Indexof lymph nodes,ILN=左側(cè)3個最大淋巴結(jié)直徑之和一右側(cè)3個最大淋巴結(jié)直

9、徑之和,取絕對值)；脾臟/體重比值(Spleen-to-body weight ratios,SBR=脾臟重量/體重×100％)。
　　 (4)外周血檢測
　　 檢測指標包括血常規(guī)和血清免疫五項(IgG、IgA、IgM、C3、C4)。
　　 (5)組織病理學(xué)觀察
　　 取下整個頰黏膜,按組織病理學(xué)常規(guī)方法固定、包埋、切片、HE染色,普通光鏡下觀察分析；以病損組織的中性粒細胞的浸潤程度、異種移植物損傷與修復(fù)

10、的情況為基礎(chǔ)進行病理分級,分級標準如下:
　　 G1:無明顯組織結(jié)構(gòu)破壞區(qū)及炎癥細胞浸潤；
　　 G1:壞死、膿腫區(qū)大部分由纖維或膠原組織包裹或替代,伴少量組織細胞、漿細胞、淋巴細胞等慢性炎癥細胞浸潤,罕見中性粒細胞；
　　 G2:壞死區(qū)被較多增生的纖維組織環(huán)繞并逐漸被吸收,面積減少?？梢娸^多的巨噬細胞、組織細胞、漿細胞、淋巴細胞和少量中性粒細胞、膿細胞浸潤；
　　 G3:少量或部分移植物出現(xiàn)壞死,伴中等

11、量的中性粒細胞浸潤；
　　 G4:部分或全部移植物凝固性壞死,伴密集的中性粒細胞或膿細胞浸潤。
　　 3.結(jié)果:
　　 (1)大體觀察:
　　 生存率:X組48天SR為87.50％,與T組和N組無顯著差別；
　　 體重:X組和T組術(shù)后體重均顯著下降,X組需要10天恢復(fù)初始體重而T組只需6天；
　　 口腔局部:X組術(shù)后3天口腔黏膜開始腫脹,7-15天腫脹、溢膿明顯,以后逐漸減輕,30天左右基

12、本消退；
　　 淋巴結(jié)腫大:X組術(shù)后7-15天SMLN顯著腫大；X-D7組的ILN明顯高于N-D7組,X-D10組顯著高于T-D10組及N-D10組；
　　 脾臟腫大:各組的SBR在所有檢測時點均無明顯差別。
　　 (2)外周血檢測結(jié)果:
　　 各實驗組的的血常規(guī)和血清免疫五項在所有檢測時點均無明顯差別。
　　 (3)組織學(xué)觀察及病理分級情況
　　 免疫病理特征:移植早期以移植物的壞死伴中

13、性粒細胞突出浸潤為特點,以天然免疫為主導(dǎo)；后期以壞死物的吸收、組織的修復(fù)伴巨噬細胞及組織細胞、漿細胞、T細胞等炎癥細胞的浸潤為特征,是天然免疫與適應(yīng)性免疫共同作用的結(jié)果。
　　 按照本研究提出的分級標準,口腔黏膜異種異體移植排斥反應(yīng)90天的觀察期可被分為如表1.2所示的0-4級,按出現(xiàn)順序概述如下:術(shù)后一周內(nèi)主要以3級病理表現(xiàn)為主,D1組、D3組91.67％(11/12)的大鼠屬于病理3級；術(shù)后7-15天,病理表現(xiàn)主要為炎癥反應(yīng)

14、最嚴重的4級,D7組、D10及D15組83.33％(15/18)大鼠屬于病理4級；術(shù)后21-30天以2級病理表現(xiàn)為主,D21組、D30組91.67％(11/12)的大鼠屬于病理4級；30天后到72天左右,1級病理表現(xiàn)明顯,D48組6只大鼠均屬于病理1級；移植術(shù)后72-90天,病理表現(xiàn)為1級向0級過渡,D72組、D90組83.33％(10/12)的大鼠屬于病理0級。
　　 4.結(jié)論:
　　 本研究初步了建立口腔黏膜異種異體

15、移植模型,為深入開展口腔黏膜移植免疫學(xué)研究提供了良好的研究工具；首次明確了口腔黏膜異種異體移植主要的病理學(xué)特征,并以此為基礎(chǔ)提出病理學(xué)分級標準；據(jù)此標準對90天觀察期的口腔黏膜移植反應(yīng)進行了相應(yīng)的病理分級。
　　 第二章中性粒細胞浸潤是大鼠口腔黏膜移植的早期事件
　　 1.研究目的:
　　 比較口腔黏膜移植早、晚期髓過氧化物酶(MPO)相對含量,以定量分析方式明確中性粒細胞的浸潤規(guī)律；進行Fk506干預(yù)實驗以明確

16、中性粒細胞在移植早期所起的作用。
　　 2.研究方法:
　　 (1)建模及分組:
　　 按照第一章方法建立移植組(X,n=24)、創(chuàng)傷組(T,n=24)和正常組(N,n=16)動物模型。其中X組、T組各12只,N組8只大鼠接受FK506處理(術(shù)前3天,2mg/kg/d加術(shù)后7天0.5 mg/kg/d口服灌胃),分別命名為FX組、FT組及FN組。
　　 (2)取材及樣本制備
　　 分別于術(shù)后D7、D

17、30處死X組、T組及N組大鼠,每時點取X組6只、T組6只,N組4只。去皮后取下整個頰黏膜和頜下淋巴結(jié),液氮凍存?zhèn)溆谩?br>　　 術(shù)后D7處死FX組、FT組及FN組大鼠,其中FX組12只、T組12只,N組8只。半數(shù)取下其整個頰部組織(從皮膚側(cè)到黏膜側(cè)),置于10％的中性福爾馬林中固定；半數(shù)去皮后取下整個頰黏膜及頜下淋巴結(jié),液氮凍存?zhèn)溆谩?br>　　 (3)ELISA方法檢測各組D7、D30口腔黏膜和/或SMLN中MPO含量。

18、　　 (4)其余觀測指標包括:口腔黏膜腫脹、滲出情況及頜下淋巴結(jié)腫大情況等。
　　 3.結(jié)果:
　　 (1)各組D7、D30口腔黏膜MPO表達情況:
　　 X-D7組MPO水平顯著高于T-D7組、N-D7組及X-D30組(三組間P<0.001)；X-D30組的MPO水平顯著高于N-D30組(P=0.042)。
　　 經(jīng)Fk506處理后,病損組織MPO水平:FX-D7組較X-D7組顯著下降(p=0.005

19、),仍高于FT-D7組及FN-D7組(P值分別為0.001和0.019)。
　　 淋巴結(jié)MPO水平:Fk506處理前、后各組頜下淋巴結(jié)處MPO的表達無顯著變化(P值均>0.05)。
　　 (2)Fk506處理前后各組大體及組織學(xué)情況
　　 另外還發(fā)現(xiàn),經(jīng)FK506處理的動物頰黏膜的腫脹、滲出及頜下淋巴結(jié)腫大明顯緩解；中性粒細胞的浸潤及移植物的破壞程度均明顯減輕。
　　 4.結(jié)論:
　　 以中性粒細

20、胞為代表的天然免疫細胞在口腔黏膜移植早期發(fā)揮重要作用,中性粒細胞浸潤是口腔黏膜移植的早期事件,加劇了移植排斥反應(yīng)。
　　 第三章口腔黏膜移植中炎癥性細胞因子趨化因子表達譜研究
　　 1.研究目的:
　　 應(yīng)用大鼠炎癥性細胞因子趨化因子PCR芯片檢測口腔黏膜移植早、晚期多種炎性細胞因子、趨化因子的表達情況,以篩選出與移植相關(guān)的差異基因并探討差異基因的生物學(xué)功能,以揭示口腔黏膜移植主要的免疫學(xué)特點和機制,為有效控制口

21、腔黏膜移植排斥提供研究基礎(chǔ)。
　　 2.研究方法:
　　 (1)建模及分組
　　 按照第一章方法建立移植組(X,n=6)、創(chuàng)傷組(T,n=6)和正常組(N,n=3)動物模型。
　　 (2)取材及樣本制備
　　 分別于術(shù)后D7、D30處死X組及T組大鼠,每組3只；N組3只大鼠在購買當天即處死。去皮后取下整個頰黏膜,液氮凍存?zhèn)溆谩?br>　　 (3)芯片檢測用樣本的制備
　　 Trizol法

22、提取組織總RNA,去除DNA并純化,質(zhì)檢合格后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
　　 (4)PCR芯片檢測與結(jié)果分析
　　 完成大鼠炎癥性細胞因子趨化因子PCR芯片(美國SABiosciences公司)的熒光定量PCR反應(yīng)。采用ΔΔCt方法計算靶基因的相對含量(β-actin為內(nèi)參)及倍數(shù)變化值；差異基因的篩選標準:從計算結(jié)果中篩選出該基因在X組中表達水平比N組上調(diào)2倍或下調(diào)2倍以上的基因,并除去T組中同樣也升高的基因。
　　

23、 3.結(jié)果:
　　 X-D7組:17種基因表達上調(diào),其中趨化因子家族10個(CCL12、CCL17、CCL22、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CXL1、CXCL2、XCR1),與中性粒細胞、巨噬細胞、NK細胞及T淋巴細胞的募集有關(guān)；細胞因子家族7個(IL-10、IL-11、IL—1Rb、IL-3、IL-4、Lta、Spp1),分別屬于Th1型、Th2型細胞因子及集落刺激因子家族,涉及調(diào)控感染、炎癥及移植免疫反應(yīng)等。

24、r>　　 X-D30組:僅有CCL24、IL-1f6表達上調(diào),前者主要與靜止的T細胞、嗜酸性粒細胞的募集有關(guān)；后者是IL-1家族新發(fā)現(xiàn)的成員,介導(dǎo)炎癥信號通路NF-kappaB和MAPKsIL-1的活化。
　　 4.結(jié)論:
　　 差異表達的趨化因子基因與中性粒細胞、巨噬細胞、NK細胞及T淋巴細胞的募集有關(guān)；Th1細胞因子型、Th2細胞因子及其它炎癥細胞因子參與了口腔黏膜移植免疫。因此推測口腔黏膜移植后的炎癥反應(yīng)是天然免

25、疫與適應(yīng)性免疫、促炎因素與抑炎因素協(xié)同作用的免疫病理過程,上述作用的失衡可能是導(dǎo)致移植物損害加劇的主要因為。
　　 第四章 CINC-1-CXCR2軸在大鼠口腔黏膜移植中的作用研究
　　 1.研究目的:
　　 分別從mRNA及蛋白水平比較口腔黏膜移植早、晚期中性粒細胞主要的趨化因子CINC-1-CXCR2軸表達的變化,以探明其表達規(guī)律與炎癥反應(yīng)間的關(guān)系；進行移植早期MPO與CINC-1和CXCR2蛋白表達的相關(guān)性

26、分析,以明確該軸在移植早期對中性粒細胞的趨化作用；Fk506干預(yù)實驗用于證實CINC-1-CXCR2軸在移植早期炎癥反應(yīng)中所起的作用。
　　 2.研究方法:
　　 (1)建模及分組
　　 按照第一章方法建立移植組(X,n=12)、創(chuàng)傷組(T,n=12)和正常組(N,n=4)動物模型。
　　 (2)熒光定量PCR及蛋白檢測用樣本的制備
　　 分別于術(shù)后D7、D30處死X組及T組大鼠,每組6只；N組4

27、只大鼠在購買當天即處死。去皮后取下整個頰黏膜,液氮凍存?zhèn)溆?。Trizol法提取組織總RNA,質(zhì)檢合格后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,凍存?zhèn)溆谩?br>　　 蛋白檢測樣本使用第二章中提取并分裝的組織蛋白樣本,與MPO檢測所用樣本來自相同的個體。
　　 (3)熒光定量RT-PCR檢測CINC-1、CXCR2的基因含量(以β-actin為內(nèi)參)。
　　 (4)ELISA法檢測各組D7、D30口腔黏膜和/或頜下淋巴結(jié)中CINC-1、CXC

28、R2蛋白水平。
　　 (5)未經(jīng)Fk506處理的D7各組MPO與CINC-1或CXCR2蛋白的Pearson相關(guān)性分析(2-tailed)。
　　 3.結(jié)果:
　　 X-D7組:CINC-1基因轉(zhuǎn)錄及蛋白水平顯著高于正常組、T-D7組、X-D30組(P值均<0.05)；CXCR2基因轉(zhuǎn)錄及蛋白水平水平也高于正常組(P值分別為0.038、0.042)。
　　 X-D30組:CINC-1基因轉(zhuǎn)錄及蛋白水平與T

29、-D30組及正常組均無顯著差別；CXCR2基因水平與T-D30組及N組無明顯差異,但其蛋白水平卻顯著高于T-D30組及N-D30組(P值分別為0.002、0.001)。
　　 FX-D7組:CINC-1、CXCR2蛋白水平在口腔黏膜的表達較X-D7組顯著降低(P值分別為0.001,0.046),但仍顯著高于FN-D7組(P值分別為0.001,0.018)。CINC-1的蛋白水平還顯著高于FT-D7組(P<0.001),而CXCR

30、2表達卻與FT-D7組卻無明顯差別。此外,數(shù)據(jù)顯示CINC-1、CXCR2蛋白在SMLN的表達與其它各組均無明顯差別。
　　 相關(guān)分析表明,MPO與CINC-1或CXCR的蛋白表達僅在X-D7組具有顯著的正相關(guān)性。
　　 4.結(jié)論:
　　 本研究結(jié)果提示:CINC-1-CXCR2軸,作為中性粒細胞主要的趨化因子在口腔黏膜移植早期與中性粒細胞的募集關(guān)系密切；該生物軸可能通過誘導(dǎo)中性粒細胞促進了口腔黏膜移植后的炎癥反