不同類型CRS的免疫病理學(xué)特性及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、第一部分：
　　 研究目的：源于白種人的研究揭示合并鼻息肉性慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis withnasal polyps，CRSwNP)和不合并鼻息肉性慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis withoutnasal polyps，CRSsNP)鼻腔粘膜表現(xiàn)出不同的炎癥形式。前者常表現(xiàn)為Th2 反應(yīng)占主導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)，而后者則呈現(xiàn)Th1 主導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。對非白種人

2、CRSwNP和CRSsNP 患者進(jìn)行系統(tǒng)研究更有利于了解慢性鼻-鼻竇炎(chronicrhinosinusitis，CRS)的發(fā)病機(jī)制。因此本研究第一步目的就是了解武漢及周邊地區(qū)CRSwNP 及CRSsNP 成人患者免疫病理學(xué)特點(diǎn)。
　　 研究方法:對50個(gè)正常下鼻甲組織、94個(gè)CRSsNP和151個(gè)CRSwNP 手術(shù)樣本石蠟切片進(jìn)行HE 染色并進(jìn)行組織學(xué)特征觀察(進(jìn)行總炎癥細(xì)胞,單個(gè)核細(xì)胞,嗜酸性粒細(xì)胞,漿細(xì)胞及粘液腺體計(jì)數(shù))

3、。根據(jù)對照組織嗜酸性粒細(xì)胞占總炎性細(xì)胞百分比的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差建立分界標(biāo)準(zhǔn)將CRSsNP和CRSwNP分為嗜酸性粒細(xì)胞性CRSsNP 及CRSwNP和非嗜酸性粒細(xì)胞性CRSsNP 及CRSwNP。另外通過對17個(gè)正常下鼻甲組織、36個(gè)CRSsNP和45個(gè)CRSwNP 手術(shù)樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析探討各種免疫細(xì)胞在對照、CRSsNP和CRSwNP中的浸潤情況,包括總T細(xì)胞(CD3+),T 輔助細(xì)胞(CD4+),細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+),

4、B細(xì)胞(CD20+)，巨噬細(xì)胞(CD68+),中性粒細(xì)胞(MPO+),樹突狀細(xì)胞(DC-LAMP+)。利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測T 輔助細(xì)胞亞型,包括Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子和相應(yīng)細(xì)胞因子在對照、CRSsNP和CRSwNP中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:于50％CRSwNP 患者表現(xiàn)為非嗜酸性粒細(xì)胞浸潤性炎癥反應(yīng)。CRSwNP 較CRSsNP 有更多的嗜酸性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD3+、CD8+、CD20+

5、和CD68+細(xì)胞浸潤,但是MPO 陽性表達(dá)率下降。盡管Th1/Th2/Th17 核轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子在CRSwNP和CRSsNP 均上調(diào),但是與對照相比二者FOXP3 及TGF-β1 mRNA表達(dá)率下調(diào)。
　　 CRSsNP 較CRSwNP 含有更高水平的IFN-γ，然而僅有嗜酸性粒細(xì)胞性CRSwNP(eosinophilic CRSwNP，Eos-CRSwNP)較CRSsNP 含有更高的Th2 核轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 水平和細(xì)

6、胞因子IL-5水平。除此之外，Eos-CRSwNP 較non-Eos-CRSwNP含有更高的Th2 炎癥反應(yīng)（Th2 核轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和細(xì)胞因子IL-5表達(dá)上調(diào)）和Th17 炎癥反應(yīng)(Th17 核轉(zhuǎn)錄因子RORC 及Th17 相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A、IL-22 及IL-23表達(dá)顯著上調(diào))。
　　 結(jié)論:國人CRSsNP和CRSwNP 成人患者均表現(xiàn)出Treg 功能受損和增強(qiáng)的Th1/Th2/Th17混合型炎癥反應(yīng)，但是C

7、RSsNP表現(xiàn)出更為突出的Th1 反應(yīng)，以Th2 為主導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)和增高的Th17 炎癥反應(yīng)僅存在于Eos-CRSwNP 而不存在于non-Eos-CRSwNP。
　　 第二部分：
　　 研究目的:
　　 在前面的研究中我們發(fā)現(xiàn)Th2 極化和突出的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥以及增強(qiáng)的Th17反應(yīng)僅存在于Eos-CRSwNP 而并非non-Eos-CRSwNP，然而與Eos-CRSwNP 相比中性粒細(xì)胞活化更多見

8、于non-Eos-CRSwNP，這些數(shù)據(jù)提示我們Eos-CRSwNP與non-Eos-CRSwNP 潛在的發(fā)病機(jī)制和過程可能存在差異，不同的T 輔助細(xì)胞免疫反應(yīng)可能是導(dǎo)致二者差異的原因。因此本研究目的就是⑴進(jìn)一步驗(yàn)證嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞在Eos-CRSwNP與non-Eos-CRSwNP中的活化狀態(tài)是否存在差異,并探討炎癥組織局部趨化嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤的化學(xué)因子; ⑵進(jìn)一步檢測各T 輔助細(xì)胞細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平及其相應(yīng)趨化

9、因子和趨化因子受體表達(dá)水平，驗(yàn)證前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及探討導(dǎo)致炎癥反應(yīng)局部各免疫細(xì)胞浸潤的直接原因; ⑶比較兩者在臨床表現(xiàn)方面是否有差異; ⑷探討Eos-CRSwNP與non-Eos-CRSwNP 形成不同免疫病理學(xué)特點(diǎn)的可能的影響因素。
　　 研究方法:
　　 根據(jù)我們前面建立的判定標(biāo)準(zhǔn)將CRSwNP分為Eos-CRSwNP與non-Eos-CRSwNP,比較兩者臨床表現(xiàn)。利用免疫組織化學(xué)方法探討及比較Eos-CRSwNP、n

10、on-Eos-CRSwNP和對照組織中嗜酸性粒細(xì)胞(MBP+)和中性粒細(xì)胞(MPO+)的活化狀態(tài)。利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法或bio-plex 蛋白檢測技術(shù)檢測嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子eotaxin、RANTES以及GM-CSF和中性粒細(xì)胞趨化因子IL-8 及GRO-α在不同組別中的表達(dá)及差異。Bio-plex 蛋白檢測技術(shù)檢測Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子IFN-γ /IL-4、IL-5、IL-13 /以及IL-17，ELISA 檢測

11、Th1、Th2 趨化因子IP-10、TARC 及MDC，實(shí)時(shí)定量RT-PCR分別檢測Th1/Th2/Th17細(xì)胞趨化因子受體CXCR3、CCR4、CCR6，Th1 趨化因子MIG、I-TAC。檢測與探討外周血總IgE、常見吸入性過敏原特異性IgE以及炎性組織勻漿總IgE和常見吸入性過敏原及葡萄球菌腸毒素A、B(staphylococcus enterotoxin A、B，SEA、SEB)特異性IgE與嗜酸性粒細(xì)胞炎癥及T細(xì)胞免疫反應(yīng)的相

12、關(guān)性。
　　 研究結(jié)果:
　　 39例CRSwNP 患者，其中Eos-CRSwNP 16例占41％，non-Eos-CRSwNP 23例占59％,二者臨床表現(xiàn)方面未見明顯差異。Eos-CRSwNP中活化嗜酸性粒細(xì)胞增多且與嗜酸性粒細(xì)胞炎癥成正比，non-Eos-CRSwNP 未見明顯嗜酸性粒細(xì)胞活化現(xiàn)象。與對照及non-Eos-CRSwNP 相比，Eos-CRSwNP 嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子eotaxin表達(dá)顯著升高,而趨

13、化因子RANTES 及GM-CSF的表達(dá)三者間并無差異。Non-Eos-CRSwNP 較Eos-CRSwNP 具有更常見的中性粒細(xì)胞浸潤與活化，然而部分Eos-CRSwNP 患者也表現(xiàn)出十分顯著的中性粒細(xì)胞炎癥。與對照相比中性粒細(xì)胞趨化因子IL-8在Eos-CRSwNP和non-Eos-CRSwNP 均顯著上調(diào)，然而細(xì)胞因子GRO-α在non-Eos-CRSwNP中的表達(dá)較對照和Eos-CRSwNP 升高。與對照和non-Eos-CRS

14、wNP 相比,組織勻漿總IgE、Th17 特異性趨化受體、Th2細(xì)胞因子IL-5、IL-13以及Th2細(xì)胞特異性趨化因子受體CCR4和Th2細(xì)胞趨化因子TARC的表達(dá)在Eos-CRSwNP 均顯著上調(diào)。與對照相比，Eos-CRSwNP中Th1細(xì)胞因子IFN-γ，Th1細(xì)胞特異性趨化因子受體CXCR3表達(dá)顯著升高，而non-Eos-CRSwNP 卻并無升高。30％ Eos-CRSwNP檢測出金黃色葡萄球菌A、B 特異性IgE 而non-E

15、os-CRSwNP 及對照均未檢測出。
　　 局部總IgE與局部嗜酸性粒細(xì)胞炎癥及Th2細(xì)胞因子IL-13表達(dá)水平呈正相關(guān)。
　　 研究結(jié)論:
　　 本研究進(jìn)一步證實(shí)Eos-CRSwNP與non-Eos-CRSwNP 具有不同的免疫病理學(xué)特性:
　　 Th2 極化和增強(qiáng)的Th17 反應(yīng)僅存在于Eos-CRSwNP 而并不存在于non-Eos-CRSwNP,而non-Eos-CRSwNP 具有更常見的中性粒

16、細(xì)胞浸潤與活化。局部IgE 可能是導(dǎo)致不同CRSwNP表型的重要原因而葡萄球菌超抗原僅參與部分Eos-CRSwNP的發(fā)病。
　　 Eos-CRSwNP中Th2 免疫細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞分別主要由TARC和eotaxin 趨化，而GRO-α可能在non-Eos-CRSwNP中中性粒細(xì)胞趨化和活化中起重要作用。
　　 第三部分：
　　 目的：觀察不伴息肉性慢性鼻-鼻竇炎（Chronic rhiosinusitis wi

17、thoutnasal polyps，CRSsNP）病理學(xué)特點(diǎn)，探討肥大細(xì)胞及活化肥大細(xì)胞在CRSsNP中的作用及其與嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的關(guān)系。
　　 方法：1.采用HE 染色對CRSsNP和對照下鼻甲組織學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行觀察以及對組織總炎細(xì)胞，單個(gè)核細(xì)胞，漿細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析.利用甲苯胺蘭和類胰蛋白酶免疫組化法分別檢測肥大細(xì)胞和活化肥大細(xì)胞在CRSsNP和對照中的浸潤情況，并探討其與組織嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的相關(guān)性。
　　

18、 結(jié)果：CRSsNP組織中總炎性細(xì)胞，單個(gè)核細(xì)胞以及漿細(xì)胞數(shù)均高于對照組，而嗜酸性粒細(xì)胞和粘膜固有層腺體數(shù)量于二者無明顯差異.肥大細(xì)胞和活化肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)呈相關(guān)性，但二者在CRSsNP和對照組中均未見明顯差異，且二者與組織嗜酸性粒細(xì)胞炎癥均無相關(guān)性。
　　 結(jié)論：CRSsNP 較正常對照具有更重的炎癥反應(yīng)，但肥大細(xì)胞及其活化以及組織嗜酸性粒細(xì)胞二者無差異，且肥大細(xì)胞及其活化與嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)無相關(guān)性，提示肥大細(xì)胞及其介導(dǎo)的嗜酸性