囊泡分子免疫病理學(xué)改變對(duì)鼻內(nèi)鏡術(shù)后鼻腔粘膜上皮預(yù)后轉(zhuǎn)歸影響的研究.pdf

1、目的：
　　 鼻息肉手術(shù)后鼻粘膜預(yù)后轉(zhuǎn)歸是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，涉及囊泡形成、多種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子及介質(zhì)等的參與。尤其是囊泡的形成對(duì)鼻粘膜上皮化可以產(chǎn)生重要影響。目前對(duì)鼻內(nèi)鏡術(shù)后鼻腔粘膜囊泡的形成機(jī)制并不清楚，臨床上是否常規(guī)要清除囊泡也存在爭(zhēng)議。本研究采用病理形態(tài)學(xué)、透射電鏡、免疫組化、細(xì)胞因子及術(shù)后不同方式處理囊泡，探討鼻內(nèi)鏡術(shù)后鼻腔囊泡的分子免疫病理形態(tài)學(xué)改變對(duì)慢性鼻息肉患者鼻腔術(shù)后粘膜預(yù)后轉(zhuǎn)歸的影響，以期為臨床鼻內(nèi)鏡術(shù)后鼻

2、腔粘膜良性轉(zhuǎn)歸提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.病例及標(biāo)本
　　 病例選自珠江醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科2010-03至2011-08行鼻內(nèi)鏡手術(shù)，術(shù)后定期隨訪且粘膜有囊泡、肉芽組織增生的慢性鼻竇炎（雙側(cè)，伴鼻息肉）患者48例（96側(cè)），其中男27例，女21例，年齡16歲到72歲，平均36.5歲。全部病例根據(jù)慢性鼻竇炎、鼻息肉診斷和治愈標(biāo)準(zhǔn)(2007EPOS標(biāo)準(zhǔn))納入[1]。所有病例統(tǒng)一手術(shù)方式及術(shù)前術(shù)后用藥情況

3、（口服或靜脈抗生素、糠酸莫米松噴鼻及鼻腔沖洗），均在鼻內(nèi)鏡下?lián)Q藥。術(shù)后換藥以術(shù)后20周內(nèi)作為研究期限。術(shù)中取下鼻甲組織（輕輕刮除）、鼻息肉組織、術(shù)后鼻腔不同時(shí)期的囊泡組織以及完成術(shù)腔上皮化后的中鼻道上皮組織。
　　 2.分組及觀察方式
　　 2.1.臨床部分:以96側(cè)術(shù)腔為研究對(duì)象，根據(jù)對(duì)囊泡處理方式的不同，將其分為囊泡刮除組和未刮除組，鼻內(nèi)鏡下觀察比較兩組術(shù)后鼻粘膜上皮化情況;同時(shí)在換藥的過程中人為地把囊泡組織劃分為輕

4、度組（單側(cè)術(shù)腔囊泡≤5個(gè)，且囊泡直徑均≤5mm）及中重度組(單側(cè)術(shù)腔囊泡＞5個(gè)或囊泡≤5個(gè)而囊泡直徑＞5mm)，觀察囊泡的差異是否影響患者術(shù)腔的上皮化進(jìn)程。
　　 2.2.實(shí)驗(yàn)室部分:隨機(jī)從臨床部分48側(cè)刮除組抽取40側(cè)術(shù)腔作為研究對(duì)象，分別在術(shù)中、術(shù)后1～3周、術(shù)后6～8周及術(shù)后11～14周等4個(gè)時(shí)段采集中鼻道及下鼻甲組織。其中中鼻道的組織為實(shí)驗(yàn)組，同期的下鼻甲組織為對(duì)照組。采用HE染色及透射電鏡方法觀察囊泡的病理形態(tài)學(xué)變化。

5、運(yùn)用免疫組織化學(xué)法探討各個(gè)時(shí)期的組織中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforminggrowthfactorβ1，TGFβ1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的表達(dá)變化。
　　 3.標(biāo)本的制備及觀察
　　 3.1.光鏡標(biāo)本
　　 標(biāo)本用10％中性福爾馬林固定，自動(dòng)脫水，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片3張，片厚4μm。分別進(jìn)行HE染色。光鏡下觀察各黏膜纖毛細(xì)胞、杯

6、狀細(xì)胞、基底膜、黏膜間質(zhì)、炎癥細(xì)胞和黏液腺體的改變。
　　 3.2.掃描電鏡標(biāo)本
　　 2.5％戊二醛-2％多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液，固定4h以上;緩沖液漂洗3次，10min/次以上;1％鋨酸-0.1mol/L磷酸緩沖液，固定1.5h;緩沖液漂洗3次，10min/次以上;50％、70％、80％、90％、100％乙醇脫水，10-15min/次;100％丙酮浸泡2次，10-15min/次;丙酮:包埋劑=1:1，浸

7、透1h;丙酮:包埋劑=1:2，浸透3h;純包埋劑浸透過夜;樣品挑出放入包埋板中聚合;60℃約48h至硬化;切1-2μm的半薄片，對(duì)照定位后，60-80nm超薄切片，撈于銅網(wǎng)上;飽和醋酸鈾，枸櫞酸鉛染色;SEM觀察纖毛數(shù)量、脫落、紊亂、黏液附著情況。
　　 3.3.炎癥因子VEGF及TGFβ1免疫組織化學(xué)染色
　　 VEGF及TGFβ1免疫組織化學(xué)采用SP法染色染色，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，以PBS替代(一)抗設(shè)立陰

8、性對(duì)照，以已知的陽性組織片作為陽性對(duì)照。圖像采集利用OLYMPUSBH-2型攝影生物顯微鏡，在40倍接物鏡下，選取陽性細(xì)胞集中的視野，調(diào)整圖像效果，使圖像的背底光密度一致。結(jié)果判定，陽性細(xì)胞可見棕黃色顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。并采用Image-ProPlus6.0軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)量免疫組化切片的陽性面積和積分光密度，通過陽性區(qū)域的平均光密度比較陽性表達(dá)的強(qiáng)弱。
　　 4.統(tǒng)計(jì)處理
　　 所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)以(X)±s表

9、示均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，選用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，術(shù)腔上皮化時(shí)間比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，各組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Satterthwaite近似t檢驗(yàn);VEGF及TGFβ1免疫組織化學(xué)表達(dá)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。，同一取材的部位組織不同時(shí)間點(diǎn)的免疫組化表達(dá)分別采用單向方差分析。Levene方差齊性檢驗(yàn)，如方差齊，多重比較采用Bonferroni法;如方差不齊，選擇方差不齊的近似F檢驗(yàn)B

10、rown-Forsythe法，多重比較方差齊性采用Dunnett'sT3法。同一時(shí)間點(diǎn)不同部位的免疫組化表達(dá)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.鼻內(nèi)鏡下囊泡形態(tài)學(xué)變化
　　 鼻內(nèi)鏡下囊泡呈淡黃或灰白色，半透明、質(zhì)軟、廣基或帶蒂囊性泡狀組織，部分內(nèi)容物為囊液，部分呈實(shí)質(zhì)性，多位于是篩竇術(shù)腔、額竇引流口。隨著術(shù)后清理過程的進(jìn)展，多數(shù)囊泡的透明度下降，部分較大的囊泡清理后創(chuàng)面會(huì)

11、再次生成新的囊泡，新生成囊泡體積常較前有所減小。囊泡表面的痂皮等分泌物也隨著時(shí)間的推移慢慢減少。鼻內(nèi)鏡下囊泡與息肉組織不易區(qū)別。
　　 2.病理學(xué)結(jié)果
　　 2.1.光鏡下囊泡組織均為假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮，術(shù)后1～3周組的囊泡組織多數(shù)表現(xiàn)為上皮剝蝕，基膜不連續(xù)，細(xì)胞間隙寬，間質(zhì)內(nèi)大量紅細(xì)胞、少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、固有層水腫，上皮層、上皮下層嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮下可見小血管及腺體增生;6～8周組的囊泡組織多數(shù)上皮層完整連續(xù)

12、，上皮層可見杯狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、纖毛柱狀上皮增多;11～14周的囊泡組織上皮層連續(xù)性良好，上皮下間質(zhì)細(xì)胞增多，腺體成熟，腺體導(dǎo)管內(nèi)及血管周圍可見嗜酸性粒細(xì)胞等浸潤(rùn);研究還發(fā)現(xiàn)有2例囊泡組織可見嗜酸性粒細(xì)胞聚集的現(xiàn)象，大量的嗜酸性粒細(xì)胞等聚集在囊泡組織的上皮下層及細(xì)胞間質(zhì)。
　　 2.2.透射電鏡下見囊泡上皮細(xì)胞有相對(duì)密集的纖毛組織，排列稍紊亂，其間可見微絨毛，大部分纖毛的橫斷面可見9+2型微管結(jié)構(gòu)，有些中心微管為9+1或者缺

13、如。而對(duì)照組鼻息肉組織透射電鏡下可見上皮細(xì)胞間隙較大，纖毛稀疏、粗細(xì)不均、線粒體腫脹等。
　　 3.分子免疫學(xué)結(jié)果顯示
　　 3.1.TGFβ1免疫組化結(jié)果顯示中鼻道組織:鼻息肉組、術(shù)后1～3周組、術(shù)后6～8周組、11～14周組的囊泡組織的陽性表達(dá)區(qū)域的平均光密度分別是0.63±0.06、0.61±0.06、0.58±0.08、0.39±0.04;同期的下鼻甲組分別是0.34±0.05、0.35±0.06、0.34±0.

14、05、0.35±0.05。細(xì)胞因子TGFβ1免疫組織化學(xué)表達(dá)的變化采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。不同取材部位即中鼻道組織和下鼻甲組織中TGFβ1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中鼻道區(qū)域的組織明顯高于下鼻甲(F=1010.957，P=0.000)。;不同的取材時(shí)間即術(shù)中、術(shù)后1～3周、術(shù)后6～8周及術(shù)后11～14周組織中TGFβ1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=73.658，P=0.000);組織采集時(shí)間和采集部位有顯著交互效應(yīng)，二者的變化趨勢(shì)明顯不同(

15、F=68.958，P=0.000)。中鼻道各組的TGFβ1隨時(shí)間一直呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=128.247;P=0.000);對(duì)應(yīng)的同期下鼻甲各組變化相對(duì)較為平緩，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.236，P=0.871)。TGFβ1主要定位于黏膜下層及間質(zhì)的炎性細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)，炎性細(xì)胞聚集的部位表達(dá)較強(qiáng)。
　　 3.2.VEGF免疫組化結(jié)果顯示中鼻道的組織即術(shù)中鼻息肉、術(shù)后1～3周組、術(shù)后6～8周組、11～14周組的囊泡組織

16、的陽性表達(dá)區(qū)域的平均光密度分別是0.28±0.03、0.22±0.03、0.34±0.05、0.23±0.03，同期的下鼻甲組織分別是0.23±0.02、0.24±0.05、0.23±0.03、0.24±0.04;不同取材部位即中鼻道組織和下鼻甲組織中VEGF的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.265，P=0.000)。不同的取材時(shí)間即術(shù)中、術(shù)后1～3周、術(shù)后6～8周及術(shù)后11～14周組織中VEGF的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.565

17、，P=0.000)。標(biāo)本采集時(shí)間和采集部位有顯著交互效應(yīng)，二者的變化趨勢(shì)明顯不同(F=49.227，P=0.000)。中鼻道的VEGF至手術(shù)后一直呈下降趨勢(shì)，至術(shù)后術(shù)后3周，然后上升，術(shù)后6周達(dá)到高峰，然后下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=94.608;P=0.000)。對(duì)應(yīng)的同期下鼻甲組織變化相對(duì)較為平緩，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.909，P=0.440);VEGF主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞、部分上皮細(xì)胞、部分腺體細(xì)胞以及極少數(shù)炎性細(xì)胞的胞質(zhì)。

18、
　　 4.囊泡嚴(yán)重程度和處理囊泡方式對(duì)鼻術(shù)后鼻腔粘膜上皮化的影響結(jié)果
　　 4.1.囊泡的輕重程度對(duì)患者的上皮化影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.628，P=0.001);術(shù)后及時(shí)刮除術(shù)腔的囊泡組織有利于加快術(shù)腔的上皮化進(jìn)程(F=11.120，p=0.000);上述兩因素不存在的交互效應(yīng)，即囊泡的嚴(yán)重程度及刮除與否對(duì)術(shù)腔黏膜的上皮化不相互影響(F=1.862，p=0.191)。
　　 4.2.中重度囊泡的兩組研究表

19、明，處理組和對(duì)照組術(shù)腔粘膜上皮化的時(shí)間分別為11.3±2.25周、13.6±3.28周。處理組即刮除囊泡組織能使術(shù)腔粘膜更快上皮化，鼻腔粘膜上皮化的時(shí)間平均縮短約1.5周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.586，p=0.014)。
　　 4.3.輕度組中兩組比較，處理組和對(duì)照組術(shù)腔粘膜上皮化的時(shí)間分別為9.9±1.71周、11.1±2.09周，囊泡組織的刮除與否對(duì)術(shù)腔粘膜上皮化進(jìn)程的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.814，p=0.075

20、）。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究依囊泡數(shù)量及大小可以而且應(yīng)該劃分為輕度組(單側(cè)術(shù)腔囊泡≤5個(gè)，且囊泡直徑均≤5mm)及中重度組(單側(cè)術(shù)腔囊泡＞5個(gè)或囊泡≤5個(gè)而囊泡直徑＞5mm)。
　　 2.術(shù)后對(duì)中重度囊泡進(jìn)行及時(shí)的清除有利于鼻腔粘膜的恢復(fù)愈合，對(duì)輕度的囊泡組織采取保留的態(tài)度，可以減少輕患者的換藥次數(shù)。
　　 3.囊泡是鼻內(nèi)鏡術(shù)后有可能經(jīng)歷的階段，其出現(xiàn)可能提示是鼻腔粘膜術(shù)后對(duì)炎癥存在的反映，存在病