Rac1基因?qū)θ死w維肉瘤HT1080細胞侵襲Ⅰ型膠原蛋白屏障的影響及機制研究.pdf

1、背景和目的：在原發(fā)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，細胞必須降解并穿過由細胞外基質(zhì)組成的組織屏障，然后通過缺損基質(zhì)進行侵襲性生長和轉(zhuǎn)移。由小GTP酶Rho家族調(diào)控的肌動蛋白動力學在細胞遷移過程中扮演了一個重要角色。細胞遷移的起始特征是肌動蛋白在細胞運動方向前沿聚合，并延伸為薄片狀的偽足。已有研究證實，Rho家族成員Rac1具有調(diào)節(jié)肌動蛋白細絲在細胞外周聚集形成板層足板，同時參與了細胞惡性轉(zhuǎn)化和誘導轉(zhuǎn)移的過程。最近的研究證實Rac1對細胞在Ⅰ型膠原

2、基質(zhì)中侵襲有直接調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了活性RacI基因的非侵襲性哺乳動物上皮細胞T47D可誘導其產(chǎn)生侵襲I型膠原的能力。同樣，銜接蛋白p130Crk相關底物(CAS)1/c-Crk Ⅱ(Crk)的過表達也可誘導在三維(3D)膠原基質(zhì)中培養(yǎng)的Rac1依賴性COS-7細胞的侵襲。但是，有關Rac1促進細胞侵襲細胞外基質(zhì)膠原屏障過程中膠原蛋白降解的機制仍不明確。 惡性腫瘤侵襲性生長與腫瘤周圍基質(zhì)蛋白降解及重塑(remodeling

3、)是高度協(xié)調(diào)發(fā)生的事件。研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可在多種癌組織中表達，且其表達的強弱與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力密切相關。細胞表面的蛋白降解活性可大大提高腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移效能，基質(zhì)金屬蛋白酶2 (MMP2、Ⅳ型膠原酶、明膠酶A)是一種與細胞表面相連的可降解Ⅰ型膠原蛋白的MMP，其活化與膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT-MMP)及金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)有密切關系。 我們研究的目的是為了進一步驗證Rac1基因的表達對腫

4、瘤細胞侵襲膠原蛋白基質(zhì)的影響，并探討Rac調(diào)控的腫瘤細胞侵襲Ⅰ型膠原蛋白組織屏障是否與啟動MT1-MMP/MMP2蛋白降解級連反應有關。 方法：我們首先在體外研究外源Rac1基因表達對人纖維肉瘤HT1080細胞(以下簡稱HT1080細胞)侵襲膠原屏障的影響，將顯性負調(diào)控突變體Rac1V12N17(HN)、結(jié)構(gòu)激活型突變體Rac1V12(HV)或空載體(HW)轉(zhuǎn)染HT1080細胞(以下分別簡稱HN、HV、HW細胞)，用G418篩選

5、轉(zhuǎn)染克隆，并擴增培養(yǎng)。用Western印跡分析檢測外源性Rac1基因表達，實驗細胞在含膠原蛋白凝膠的3D基質(zhì)中培養(yǎng)，用得克薩斯紅結(jié)合的鬼筆環(huán)肽染色顯示細胞肌動蛋白。在用膠原蛋白凝膠覆蓋濾膜的Transwell小室進行細胞穿膜侵襲實驗，并觀察二種蛋白酶抑制劑對上述細胞侵襲實驗的影響。 然后，對3D膠原蛋白和纖維蛋白細胞培養(yǎng)體系中的細胞裂解液和培養(yǎng)液，采用明膠和膠原蛋白酶譜分析法觀察Rac1對多種基質(zhì)金屬蛋白酶活化的影響;采用Wes

6、tern印跡法觀察Rac1對基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)表達的影響。同時，我們還觀察了不同蛋白酶抑制劑對Rac1介導的MMP2活化的影響。 我們采用Northern印跡法和Western印跡法檢測在3D基質(zhì)培養(yǎng)體系中，由于外源突變Rac1基因?qū)T1080細胞的MT1-MMP轉(zhuǎn)錄、表達及MT1-MMP的降解片段的影響；采用膠原蛋白降解實驗觀察轉(zhuǎn)染后的HT1080細胞對膠原蛋白薄膜的降解能力的變化；采用穿膜(transwell)實

7、驗觀察了特異性MMP2抑制劑對Rac1介導的HT1080細胞侵襲膠原蛋白屏障的影響。 結(jié)果：對分別轉(zhuǎn)染HN突變體、HV突變體和HW空載體的HT1080細胞，用Western印跡法檢測Rac1的表達。結(jié)果顯示，HN和HV細胞均有內(nèi)源性和外源性Racl表達，HW細胞僅見內(nèi)源性Rac1表達。熒光顯微鏡觀察，在3D膠原蛋白凝膠中培養(yǎng)的不同轉(zhuǎn)染細胞呈現(xiàn)明顯不同的細胞形態(tài)和排列結(jié)構(gòu)。細胞侵襲實驗顯示HV細胞侵襲膠原屏障的能力大于HW細胞，而

8、后者又強于HN細胞，這種差別在應用廣譜MMPs抑制劑后消失，抑肽酶則無此影響。 在3D膠原蛋白凝膠培養(yǎng)體系中，與HW細胞比較，HV細胞的裂解液和培養(yǎng)液中均可觀察到MMP2活化增強，而HN細胞則呈相反改變。在3D纖維蛋白凝膠培養(yǎng)體系中，HW和HN細胞裂解液和培養(yǎng)液中均未見活化的MMP2:而HV細胞則可觀察到活化的MMP2。 廣譜MMPs抑制劑SC68180可消除HV細胞裂解液和培養(yǎng)液中MMP2活化的增強，而另一種蛋白酶抑制

9、劑，抑肽酶，則沒有這種抑制效應。在3D膠原蛋白基質(zhì)中，與HW細胞比較，HV細胞的MT1-MMP轉(zhuǎn)錄水平，以及蛋白表達和降解明顯升高，而HN細胞三者均呈現(xiàn)下降改變。 與HW細胞比較，HV細胞降解膠原蛋白薄膜的能力明顯增強；相反，HN細胞降解能力則減弱。HV細胞的MMP2活化增強可被其特異性抑制劑CTD所減弱，這種減弱效應呈濃度依賴性。膠原蛋白屏障侵襲實驗也表明，TIMP2、FI(佛林蛋白酶抑制劑)和MMP2抑制劑CTD可顯著減弱結(jié)