滋補(bǔ)脾陰方藥保護(hù)譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞抗過氧化損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：脊髓損傷是骨科的常見多發(fā)傷，后果嚴(yán)重，預(yù)后差，臨床治療效果尚不滿意。近年來人們逐漸認(rèn)識到脊髓損傷后的永久性神經(jīng)損害是原發(fā)損傷引起的一系列繼發(fā)反應(yīng)所致。通過大量研究，有學(xué)者認(rèn)為可以通過神經(jīng)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷，而譜系限制性神經(jīng)前體細(xì)胞(NRPs細(xì)胞)是目前較好的選擇。然而在不斷改進(jìn)移植方式的同時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)損傷脊髓的局部微環(huán)境對移植的成敗也起到了至關(guān)重要的作用。 我校長期對“滋補(bǔ)脾陰方藥”進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其有保護(hù)脊髓繼發(fā)損傷，

2、提高腦神經(jīng)線粒體膜抗氧化的能力。本藥是否可以克服損傷脊髓微環(huán)境，提高移植細(xì)胞存活率是一嶄新課題，有待于進(jìn)一步研究。 目的：研究滋補(bǔ)脾陰方藥對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)限制性神經(jīng)元前體細(xì)胞(NRPs細(xì)胞)脂質(zhì)過氧化損傷的保護(hù)作用，為進(jìn)一步體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)治療脊髓損傷奠定基礎(chǔ)。 方法：取SD大鼠胚胎脊髓，行原位免疫熒光鑒定確認(rèn)為NRPs細(xì)胞。將脊髓消化吹打后貼壁培養(yǎng)3-5天，利用流式細(xì)胞儀行抗Nestin、抗PSA-NCAM、抗A

3、285免疫熒光鑒定，確認(rèn)培養(yǎng)的細(xì)胞為NRPs細(xì)胞。利用紅外光譜對含藥血清和空白血清成分進(jìn)行測定，確認(rèn)含藥血清和空白血清成分有所不同，滋補(bǔ)脾陰方藥確實(shí)進(jìn)入到血清中。建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，將?xì)胞分為正常組、損傷組、空白血清干預(yù)組、中藥血清干預(yù)組、空白血清干預(yù)后損傷組、中藥血清干預(yù)后損傷組。其中血清濃度分別為0.25％、0.5％、1％、2％、4％，預(yù)保護(hù)時(shí)間為8小時(shí);H2O2濃度分別為0.05、0.1、0.2mmol/L，損傷時(shí)間為4小時(shí)。將各組于倒

4、置相差顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行一般形態(tài)學(xué)觀察和分組比較；利用MTT法計(jì)算各組細(xì)胞存活率：并對各組進(jìn)行Hoechst染色，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況：檢測細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA含量，得知細(xì)胞狀態(tài)和受損程度，確定滋脾陰方藥血清保護(hù)作用及最佳保護(hù)濃度。 結(jié)果：H2O2可造成細(xì)胞MDA增高，SOD下降，符合脂質(zhì)過氧化特征,并使細(xì)胞存活率降低，加快細(xì)胞凋亡，與H2O2濃度呈正性關(guān)系。滋補(bǔ)脾陰方藥在0.25-2％濃度下對H2O2誘導(dǎo)的過氧化

5、損傷細(xì)胞有保護(hù)作用，可以提高細(xì)胞存活率，預(yù)防NRPs細(xì)胞在脂質(zhì)過氧化損傷下SOD的減少，并抑制MDA的生成。且在1％濃度時(shí)最保護(hù)能力最強(qiáng)。但含藥血清大于4％濃度后便呈現(xiàn)出較明顯的藥理毒性作用，可以加快細(xì)胞的凋亡。 結(jié)論：滋補(bǔ)脾陰方藥血清在一定濃度下有抗脂質(zhì)過氧化損傷作用，可以預(yù)防細(xì)胞SOD下降，減少M(fèi)DA生成，提高了NRPs細(xì)胞在脂質(zhì)過氧化條件下的存活率和存活狀態(tài)，且在1％濃度時(shí)能發(fā)揮最佳保護(hù)作用。而空白血清對NRPs細(xì)胞無明顯