滋補(bǔ)脾陰方藥對(duì)脾陰虛糖尿病腦病大鼠海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響的研究.pdf

1、目的：糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一組慢性血葡萄糖（簡(jiǎn)稱血糖）水平增高為特征的代謝性疾病，是由千胰島素分泌和（或）作用缺陷所引起的。2型糖尿病以胰島素抵抗為其特征。糖尿病可以引起多系統(tǒng)的損害，導(dǎo)致心臟、腎臟、神經(jīng)、視網(wǎng)膜、血管等組織器官的慢性進(jìn)行性改變，糖尿病腦?。╠iabetic encephalopathy，DE）是糖尿病慢性并發(fā)癥之一。其主要表現(xiàn)為輕中度的認(rèn)知功能障礙、學(xué)習(xí)和記憶能力下降。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

2、應(yīng)激與糖尿病的發(fā)生存在著密切的關(guān)系。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是細(xì)胞的一種應(yīng)激反應(yīng)過程，糖饑餓、鈣平衡紊亂、糖基化抑制、二硫鍵合成減少等情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微環(huán)境發(fā)生改變，蛋白質(zhì)折疊受到影響，導(dǎo)致大量未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，由此引起未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。UPR可以引起分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 （glucose reg

3、ulated protein 78，GRP78）的活化，使其與抑制物阻抗性酯酶1（inositol-requiring enzyme，IRE1）、RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase， PERK）和活化的轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）解離，PERK與GRP78分離后低聚化和自身

4、磷酸化并使真核起始因子2的α亞單位（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）磷酸化，引起蛋白質(zhì)翻譯抑制以減少新蛋白質(zhì)的合成，阻止蛋白的進(jìn)一步積聚。PERK和eIF2α磷酸化標(biāo)志著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。糖尿病腦病屬于中醫(yī)消渴病的合并癥，其病位在腦，涉及肝、腎、心、脾諸臟，病性多為本虛標(biāo)實(shí)，陰虛燥熱。脾為后天之本，氣血生化之源，氣血為人體生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，脾虛一方面引起運(yùn)化不足，水谷

5、精微和津液不能正常輸布排泄，積于體內(nèi)，發(fā)為消渴；另一方面則引起氣血生化不足，腦髓失養(yǎng)，神機(jī)失調(diào)而發(fā)病。滋補(bǔ)脾陰方藥（ZBPYR）是戰(zhàn)麗彬教授根據(jù)吳澄《不居集》中資成湯化裁而成。為進(jìn)一步探討ZBPYR對(duì)脾陰虛糖尿病腦病大鼠海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，我們建立脾陰虛糖尿病腦病病證結(jié)合模型，應(yīng)用ZBPYR進(jìn)行干預(yù)，觀察模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的行為學(xué)變化，并通過Western Blotting的方法探討ZBPYR對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，旨在從蛋白水

6、平探討ZBPYR的新靶點(diǎn)，為糖尿病腦病的治療提供新的治療線索。 方法： 1.SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、脾陰虛組、糖尿病腦病組、脾陰虛糖尿病腦病組和脾陰虛糖尿病腦病+ZBPYR治療組，每組4只。 2.適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，空白對(duì)照組和脾陰虛組仍以普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病腦病組、脾陰虛糖尿病腦病組和脾陰虛糖尿病腦病+ZBPYR治療組喂食高脂飼料，4周后大鼠按30mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)一次性腹腔

7、注射1%的鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）溶液，建立糖尿病模型。72h后尾靜脈采血測(cè)量隨機(jī)血糖，隨機(jī)血糖>16.7mmol/L的大鼠確定為糖尿病模型。在STZ注射后的第4、8、12天分別檢測(cè)空腹血清胰島素水平（fasting serum insulin，F(xiàn)SI），進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)（insulin tolerance test，ITT）

8、。糖尿病模型成功建立后，在此基礎(chǔ)上通過疲勞過度加饑飽失常的復(fù)合因素造模的方法建立脾氣虛證模型，共18天。之后造模大鼠灌服傷陰藥，共9天，建立脾陰虛糖尿病腦病病證結(jié)合模型。脾陰虛糖尿病腦病+ZBPYR治療組大鼠給予ZBPYR治療，共16天。治療結(jié)束后斷頭取腦。造模期間觀察各組大鼠的體征變化。 3.通過跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，比較各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的改變。 4.通過Western Blottin

9、g方法檢測(cè)各組大鼠海馬GRP78、PERK和eIF2α蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1.STZ注射后糖尿病模型大鼠隨機(jī)血糖明顯高于非糖尿病模型大鼠（P<0.01）。口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明糖尿病模型大鼠各時(shí)間點(diǎn)血糖均高于非糖尿病模型大鼠（P<0.05），且出現(xiàn)糖耐量異常；胰島素耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糖尿病模型大鼠血糖降低速率比非糖尿病模型大鼠小，說明糖尿病模型大鼠存在胰島素抵抗現(xiàn)象。空腹血清胰島素水平糖尿病模型大鼠與非糖尿病模型

10、大鼠無明顯差異。 2.脾陰虛組表現(xiàn)出飲水量增加（P<0.01），肛溫升高（P<0.05）等陰虛內(nèi)熱癥狀；行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示糖尿病腦病組和脾陰虛糖尿病腦病組學(xué)習(xí)記憶力降低（P<0.05）；脾陰虛糖尿病腦病+ZBPYR組學(xué)習(xí)記憶能力有所改善（P<0.05）。 3.Western Blotting結(jié)果顯示糖尿病腦病組、脾陰虛糖尿病腦病組大鼠海馬GRP78、磷酸化PERK、磷酸化eIF2α水平均明顯高于空白對(duì)照組和脾陰虛組（P<

11、0.05），脾陰虛糖尿病腦病+ZBPYR組與脾陰虛糖尿病腦病組相比GRP78、磷酸化PERK、磷酸化eIF2α水平明顯降低（P<0.05）。PERK、eIF2α總蛋白水平各組間沒有差異。 結(jié)論： 1.脾陰虛糖尿病腦病大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK信號(hào)途徑被啟動(dòng)有關(guān)。 2.脾陰虛糖尿病腦病大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙可能與大鼠海馬中GRP78蛋白水平增加、磷酸化PERK以及磷酸化eIF2α的表達(dá)增加有關(guān)。 3