蛋氨酸對雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1表達(dá)的影響及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(Endogenous retrovirus，ERV)作為基因組成分，其生物學(xué)功能正在被逐漸認(rèn)識。近年來的研究表明在哺乳動物中內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)受營養(yǎng)因素和表遺傳的調(diào)控，而內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒可通過調(diào)控先天免疫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子來參與先天免疫反應(yīng)。然而，有關(guān)家禽的ERV研究還相當(dāng)有限。比如，家禽營養(yǎng)因子是否調(diào)節(jié)ERV的表達(dá)，ERV是否受表遺傳調(diào)控，營養(yǎng)因子是否通過調(diào)控ERV來影響動物的先天免疫反應(yīng)等。本研究將圍繞這些問題進(jìn)行

2、研究，試圖闡明營養(yǎng)因子對雞ERV表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1、雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1基因序列及其表達(dá)分析:
　　利用鏈特異性引物，以雞巨噬細(xì)胞HD11基因組為模板進(jìn)行ALVE1全長序列PCR分段擴(kuò)增，測序結(jié)果表明克隆測序的ALVE1基因序列與NCBI公布的ALVE1序列同源性達(dá)到99％，但多個位點存在核苷酸多態(tài)性。利用熒光定量PCR檢測ALVE1在CEF細(xì)胞和HD11細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及ALVE1 e

3、nv基因在2日齡和35日齡SPF雞不同組織（腦、法氏囊、胸腺、脾臟、心臟、肝臟、腎臟、肺臟和皮膚）中的表達(dá)量，結(jié)果顯示:env基因在免疫細(xì)胞HD11中的表達(dá)量顯著高于非免疫細(xì)胞CEF(P＜0.05);在2日齡雞免疫器官脾臟中的表達(dá)量也高于其他組織(P＜0.05)，而且2日齡SPF雞免疫器官（脾臟和法氏囊）中env的表達(dá)量顯著高于35日齡的SPF雞(P＜0.05)。以上結(jié)果提示ALVE1可能參與雞早期免疫器官的形成及早期先天免疫反應(yīng)。不過

4、，該推測還有待進(jìn)一步研究加以驗證。
　　2、營養(yǎng)因子對ALVE1表達(dá)的影響
　　在培養(yǎng)基中分別用蛋氨酸和維生素C處理雞細(xì)胞，然后用qPCR檢測ALVE1和先天免疫基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，蛋氨酸激活了雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒LTR序列的轉(zhuǎn)錄，并伴有先天免疫相關(guān)基因表達(dá)的顯著上長升(P＜0.05)。然而，維生素C處理對ALVE1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)沒有顯著影響(P＞0.05)。
　　3、ALVE1區(qū)CpG到的甲基化分析
　　生物信息

5、學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)ALVE1基因存在兩個CpG甲基化島，且ALVE1 env轉(zhuǎn)錄物存在miR-155作用位點。DNA甲基化酶抑制劑AZA處理HD11細(xì)胞后，焦磷酸測序的結(jié)果表明:ALVE1 CpG島的DNA甲基化水平降低，且伴有ALVE1基因和先天免疫相關(guān)基因的表達(dá)激活。再者，利用Overlap PCR以及熒光素酶報告系統(tǒng)，研究證實miR-155可靶向env的轉(zhuǎn)錄物。以上結(jié)果表明:ALVE1的表達(dá)受表觀遺傳學(xué)機(jī)制的調(diào)控，且ALVE1的表達(dá)激活可

6、能參與先天免疫反應(yīng)。另外，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ALVE1 env基因，使其過表達(dá)近40倍，但并未對所測先天免疫基因的表達(dá)產(chǎn)生顯著影響，這可能是反義RNA表達(dá)激活的缺失所致。
　　綜上所述，雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1 env基因在雞免疫細(xì)胞以及免疫器官中高表達(dá)，特別是雞的早期生長階段。ALVE1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到蛋氨酸、miR-155以及DNA甲基化的調(diào)控。營養(yǎng)因子-蛋氨酸可能通過誘導(dǎo)ALVE1的表達(dá)來激活先天免疫基因的表達(dá)，影響動物的免疫