人臍血間充質干細胞攜帶人腫瘤壞死因子a基因逆轉絨癌耐藥的體外研究.pdf

1、目的：對化療藥物產生耐藥性是絨癌治療失敗的主要原因之一。人腫瘤壞死因子(huTNF-a)基因的轉導的確能在mRNA水平和蛋白水平逆轉絨癌耐藥細胞株的多藥耐藥基因(MDR1)，增加絨癌耐藥細胞對細胞毒性藥物的敏感性。全身應用TNF-a能引起嚴重的副反應，而且外源性TNF-a通過層層障礙到達腫瘤細胞后，真正與腫瘤細胞發(fā)生作用的很少。尋找理想的轉基因的載體，將TNF-a帶到腫瘤局部發(fā)揮作用，成為解決問題的關鍵。間充質干細胞(MSCs)具備成為

2、轉基因載體的很多優(yōu)勢，例如：分布廣泛，易于獲得，有很強的復制、擴增能力，更重要的是具有腫瘤趨化特性。本研究通過腺病毒介導huTNF-a基因轉染人臍血間充質干細胞(huUCB-MSCs)，與絨癌耐藥細胞株共培養(yǎng)后，觀察耐藥細胞株耐藥指數的變化及huUCB-MSCs對腫瘤細胞的定向趨化能力。 方法：利用人的臍帶血分離、培養(yǎng)、純化獲得huUCB-MSCs，并鑒定之。構建攜帶huTNF-a基因的腺病毒載體Ad5-TNFa-IRES-EG

3、FP，用之感染體外培養(yǎng)的huUCB-MSCs，酶聯免疫吸附試驗(Elisa)檢測不同時間點轉染細胞上清液中TNF-a濃度，采用細胞病變結晶紫染色法測定上清液中TNF-a的活性；用免疫印跡方法(Western Blot)及逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測huTNF-a基因在轉染細胞中的表達。采用間歇誘導的方法成功建立絨癌耐藥細胞株JEG-3/VP16并鑒定它的耐藥性。將JEG3-VP16和攜帶huTNF-a基因的huUCB-MSC

4、s共培養(yǎng)，MTT法測定共培養(yǎng)后JEG3-VP16耐藥指數。應用穿孔試驗法研究攜帶huTNF-a基因的huUCB-MSCs對JEG3-VP16的定向趨化及遷移能力。 結果：來源于人臍帶血的單個核細胞經體外培養(yǎng)貼壁后出現類似成纖維細胞形態(tài)的間充質干細胞(MSCs)。該細胞表達MSCs的相關抗原CD29、CD44、CD90，但不表達造血干細胞的相關抗原CD34、CD45，這與源于骨髓的MSCs一致。對體外培養(yǎng)的MSCs進行成骨和成脂肪

5、誘導后，多數細胞表現出成骨和成脂肪的能力。采用AdMax包裝系統制備出以綠色熒光蛋白(EGFP)作為報告基因的腺病毒載體Ad5-TNFa-IRES-EGFP。測定病毒滴度為5.2×108PFU/ml。熒光顯微鏡觀察到攜帶huTNF-a基因的腺病毒高效率感染huUCB-MSCs。RT-PCR檢測到huUCB-MSCs中huTNFa的mRNA的表達，Western Blot沒有檢測到TNFa蛋白表達。ELISA結果顯示轉染后16h-48h內

6、huUCB-MSCs上清液中的huTNFa濃度呈漸進上升的趨勢，并可持續(xù)分泌到轉染后10天。結晶紫染色法提示轉染后上清液中TNFa有活性。成功誘導絨癌耐藥細胞株JEG3-VP16并用MTT法鑒定其耐藥性。JEG-3/VP16和轉染huTNFa基因的huUCB-MSCs共培養(yǎng)后，MTT法測定jeg-3/vp16對VP16、5FU、MTX的IC50分別下降了12.8，6.75和10.1倍；而與未感染huTNFa的huUCB-MSCs共培養(yǎng)的

7、jeg-3/vp16的IC50只分別下降了1.08，1.22和1.05倍。說明攜帶TNFa基因的huUCB-MSCs能逆轉jeg-3/vp16的耐藥性。穿孔實驗結果顯示JEG-3/VP16組的光密度值(0.39±0.03)顯著高于空白對照組(0.11±0.08)及成纖維細胞組(0.10±0.05)，說明JEG-3/VP16組定向遷移的huUCB-MSCs數量明顯多于成纖維細胞對照組和空白對照組，即huUCB-MSCs對腫瘤細胞有定向趨化

8、遷移的能力。 結論：人臍血中含有豐富的MSCs足夠滿足體外實驗需要。MSCs具有轉基因載體的諸多優(yōu)勢，在本實驗中成功扮演了huTNFa基因載體的角色。腺病毒介導的huTNFa基因轉染huUCB-MSCs具有高效性。攜帶huTNFa基因的huUCB-MSCs與絨癌耐藥細胞株JEG-3/VP16共培養(yǎng)后，逆轉了JEG-3/VP16的耐藥性，而且JEG-3/VP16對感染huTNFa基因的huUCB-MSCs有定向趨化作用。轉基因間充