精氨酸對(duì)小鼠DDK綜合癥的影響及其修飾基因定位研究.pdf

1、DDK綜合癥是一種以小鼠早期胚胎死亡為表型的繁殖現(xiàn)象，其主要表現(xiàn)為:當(dāng)DDK品系雌鼠與同亞種內(nèi)其他品系雄鼠雜交時(shí)，胚胎因形成胚泡障礙不能著床而死亡;而DDK雄鼠與其他品系雌鼠雜交時(shí)胚胎則均能正常發(fā)育。小鼠卵子突變基因（Ovum mutant，Om）被認(rèn)為是導(dǎo)致該綜合癥的突變基因，然而該基因序列及作用機(jī)制目前仍不清楚。本研究旨在通過(guò)在小鼠日糧中添加不同濃度的精氨酸觀察其對(duì)DDK綜合癥胚胎的影響，以及精氨酸代謝與DDK綜合癥間的關(guān)系;同時(shí)研

2、究中通過(guò)尋找DDK綜合癥的修飾基因，以揭示Om基因位點(diǎn)雜合雌鼠與C57BL/6(B6)回交后胚胎死亡率偏離半數(shù)致死的原因。本研究通過(guò)營(yíng)養(yǎng)和基因兩個(gè)方面共同探討對(duì)DDK綜合癥胚胎的影響，為最終解釋DDK綜合癥的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。本研究共分三部分進(jìn)行:
　　第一部分研究小鼠日糧中添加不同濃度精氨酸對(duì)DDK綜合癥的影響。實(shí)驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選用120只F1（B6♀×DDK♂）代雌鼠，隨機(jī)分為3組，分別飼喂精氨酸含量為1.10％、1.

3、34％和1.59％的日糧。妊娠12天解剖，觀察存活胎子數(shù)和著床數(shù)，檢測(cè)子宮胎盤內(nèi)一氧化氮含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂1.34％的精氨酸組其著床數(shù)顯著高于1.10％和1.59％組(P＜0.05)。同時(shí)，1.34％組的存活胎子數(shù)最高，但與其他兩組相比，均未達(dá)到顯著性差異(P＞0.05)。子宮胎盤內(nèi)一氧化氮檢測(cè)結(jié)果顯示，小鼠日糧中添加1.34％和1.59％的精氨酸其一氧化氮含量均顯著高于1.10％組(P＜0.05)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠日糧中添加

4、1.34％精氨酸對(duì)提高DDK綜合癥胚胎的成活率有一定幫助，但差異不顯著;子宮胎盤內(nèi)一氧化氮的檢出，表明DDK綜合癥胚胎死亡和精氨酸缺乏及一氧化氮代謝障礙間無(wú)直接關(guān)系。
　　第二部分初步定位DDK綜合癥的修飾基因。實(shí)驗(yàn)利用與Om基因緊密連鎖的D11Mit36、D11Mit66和D11Mit247三個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記，篩選雜合型N2雌鼠構(gòu)建修飾基因定位群體。同時(shí)，采用凝膠電泳法篩選在DDK和B6品系間具有多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，利用篩選

5、到的分子標(biāo)記對(duì)作圖全體進(jìn)行全基因掃描。收集雜合型N2雌鼠妊娠12天的存活胎仔數(shù)和胚胎著床數(shù)作為表型數(shù)據(jù)。最后采用WinQTLCart2.5軟件中的復(fù)合區(qū)間作圖法結(jié)合全基因掃描結(jié)果和表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位分析，初步尋找加重DDK綜合癥的修飾基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究共篩選到289只N2雜合型雌鼠構(gòu)建作圖群體，其篩選比例為23.94％。篩選到67條具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物，篩選比例為25.97％，平均每條染色體上有3.53個(gè)標(biāo)記，標(biāo)記間平均距

6、離為18.56cM。收集到的表型數(shù)據(jù)顯示存活胎子數(shù)平均為2.57只，而著床數(shù)平均為3.59只，且均符合正態(tài)分布。結(jié)合19363個(gè)全基因掃描結(jié)果和表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL分析后發(fā)現(xiàn)，存活胎子數(shù)在第幾號(hào)染色體上有一個(gè)明顯高峰，其最大LOD值為3.5，超過(guò)了2.9的顯著性LOD值，因此認(rèn)為該位點(diǎn)是一個(gè)主效修飾基因位點(diǎn)，并將其命名為Amom1，該位點(diǎn)位于小鼠第幾號(hào)染色體上的38.9-51.9cM區(qū)間。而著床數(shù)雖然也在第九號(hào)染色體上也有一個(gè)高峰，但其最

7、大LOD值為2.3，未達(dá)到顯著性LOD值2.5的水平，因此，認(rèn)為該位點(diǎn)不是一個(gè)顯著性修飾基因位點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在B6品系遺傳背景中定位到一個(gè)主效修飾基因位點(diǎn)，該位點(diǎn)可以加重DDK綜合癥，使得胚胎成活率進(jìn)一步降低。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋了Om位點(diǎn)雜合雌鼠與B6品系回交胚胎死亡偏離半數(shù)致死的原因。
　　第三部分對(duì)Amom1修飾基因位點(diǎn)進(jìn)行精細(xì)定位。本研究在初步定位的基礎(chǔ)上通過(guò)擴(kuò)大定位群體，增加高密度分子標(biāo)記等方法，以進(jìn)一步精細(xì)定位Amom

8、1位點(diǎn)。在精細(xì)定位后，結(jié)合小鼠資源庫(kù)及生物信息學(xué)方法，尋找Amom1位點(diǎn)內(nèi)的候選基因，為最終克隆DDK綜合癥修飾基因奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究在小鼠第九號(hào)染色體上篩選到高密度分子標(biāo)記28個(gè)，篩選率為21.88％，Amom1位點(diǎn)內(nèi)分子標(biāo)記間距為0.93cM。增加了56個(gè)有效樣本，使作圖群體達(dá)到了345只。利用作圖群體的存活胎子數(shù)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL分析，并采用1.5LOD-drop的方法進(jìn)行置信區(qū)間估測(cè)。QTL分析結(jié)果表明，Amom1位

9、點(diǎn)置信區(qū)間為47.7-49.1cM間，大約1.4cM。該位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率為10.56％，加性效應(yīng)為-1.46，顯性效應(yīng)為12.72。通過(guò)NCBI和MGI數(shù)據(jù)庫(kù)分析該區(qū)間對(duì)應(yīng)90700-94500Mb，包含有效基因19個(gè)，其中12個(gè)為未知基因，4個(gè)為Plscr家族基因，2個(gè)為Zic家族基因和1個(gè)Plod家族基因。下一步的研究需要對(duì)19個(gè)基因進(jìn)行更進(jìn)一步的篩選，并對(duì)篩選出來(lái)的候選基因進(jìn)行功能性驗(yàn)證。
　　綜合以上研究結(jié)果，小鼠日糧中添加1