角膜真菌感染黏附分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、青島大學(xué)博士學(xué)位論文角膜真菌感染黏附分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究姓名：潘曉晶申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：眼科學(xué)指導(dǎo)教師：謝立信20090522制劑和真菌刺激的細(xì)胞作為空白對照，各組相互作用4 8 h ，對穿過M a t r i g e l 到達(dá)濾膜下方的人角膜上皮細(xì)胞進(jìn)行H E 染色，拍照記錄并測定積分光密度，以評價(jià)真菌及其代謝產(chǎn)物對人角膜上皮細(xì)胞移行功能的影響，并進(jìn)一步探討F A K 在上述過程中的作用。第三部分黏附相關(guān)蛋白在小鼠角膜真菌感染中的表

2、達(dá)選用近交系B A L B ／e 小鼠，應(yīng)用角膜表層鏡法，即在小鼠角膜表面覆蓋大鼠角膜片，二者層間注入菌液( 1 0 6 C F U ) ，縫合眼瞼，建立三種常見致病真菌( 白色念珠菌、煙曲霉菌和茄病鐮刀菌) 的真菌性角膜炎動物模型。染料木黃酮處理組在角膜接種菌液前6 0 m i n ，環(huán)繞實(shí)驗(yàn)眼角膜緣球結(jié)膜下注射F A K 特異性抑制劑染料木黃酮( 2 0 0 I _ t M ) 1 0 u l ，實(shí)驗(yàn)組注射等量0 ．0 2 M P

3、B S 。裂隙燈顯微鏡觀察接種菌液后6 、1 2 、1 8 、2 4 和4 8 h 角膜病變特點(diǎn)，拍照記錄；應(yīng)用H E 染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測以上各時(shí)間點(diǎn)L N 、I T 0 1 3 1 和F A K 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：第一部分M T T 法檢測F A K 抑制劑( 染料木黃酮) 終濃度2 0 0 u M 是對細(xì)胞毒性較小的最大抑制濃度。細(xì)胞外基質(zhì)( L N 、F N ) 、跨膜蛋白整合素I T G l 3

4、 1 ，以及F A K 信號通路中F A K 和P A X 基因均參與真菌與人角膜上皮細(xì)胞的黏附過程；F A K 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在人角膜上皮細(xì)胞與真菌接觸后快速啟動并激活下游蛋白，應(yīng)用抑制劑后信號蛋白表達(dá)均不同程度減低；免疫細(xì)胞化學(xué)觀察人角膜上皮細(xì)胞與真菌相互作用過程中L N 、F N 和F A K 表達(dá)均增強(qiáng)，其中F A K 表達(dá)呈強(qiáng)陽性；激光共聚焦顯微鏡顯示F N 定位于細(xì)胞外基質(zhì)，F(xiàn) A K 和P A X 定位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，并發(fā)

5、現(xiàn)真菌刺激后，細(xì)胞骨架發(fā)生明顯變化；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示真菌與I T G l 3 1 在瞬間迅速結(jié)合，染料木黃酮可明顯抑制P A X 表達(dá)；光學(xué)顯微鏡和積分光密度結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了真菌黏附及染料木黃酮的抑制作用；電子顯微鏡觀察到真菌黏附后人角膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)紊亂、胞膜邊緣波動和細(xì)胞內(nèi)吞等超微結(jié)構(gòu)的改變。第二部分利用T r a n s w e l l 小室成功構(gòu)建三種常見致病真菌與人角膜上皮細(xì)胞相互作用的模型，接種真菌及其代謝產(chǎn)物