液相核酸芯片診斷角膜常見致病真菌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文液相核酸芯片診斷角膜常見致病真菌的實(shí)驗(yàn)研究姓名：董燕玲申請學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：眼科學(xué)指導(dǎo)教師：謝立信20080401山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文7 、利用所制備的真菌診斷用液相芯片對4 2 株臨床分離菌株進(jìn)行菌種鑒定，確定其檢測靈敏度并與P C R 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行比較。8 、用同一批次芯片同時(shí)對5 種待測真菌進(jìn)行4 次重復(fù)檢測，評估芯片的檢測重復(fù)性。結(jié)果1 、選取茄病鐮刀菌、串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、煙

2、曲霉菌和黃曲霉菌作為本研究的待測真菌菌種，由其引起的角膜感染占我國真菌性角膜炎總發(fā)病率的8 0 ％左右。2 、根據(jù)公司的推薦及查閱資料選擇3 號(hào)、5 號(hào)、7 號(hào)、2 0 號(hào)、3 5 號(hào)、4 7 號(hào)和7 9 號(hào)羧基化微球。3 、5 株標(biāo)準(zhǔn)菌株和4 2 株臨床分離菌株基因組D N A 的P C R 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳均可見清晰、單一的電泳條帶，片段大小位于5 0 0 “ - 一6 0 0 b p 之間，將其純化后測序，可見測序所得序列

3、與從G c n e b a n k 上查得的相應(yīng)序列基本一致。4 、所設(shè)計(jì)的種特異性探針及質(zhì)控探針的序列為：茄病鐮刀菌 G C A C A C G C C G T C C C T C A A A T A C串珠鐮刀菌 T C G r I - 】隊(duì)C T G G T A A T C G T C G C G G尖孢鐮刀菌 C T C A A G C C C T C G G G T T T G G T G T煙曲霉菌 C G C C A G

4、C C G A C A C C C A A C T T T A黃曲霉菌T G C C G A A C G C A A A T C A A T C T陽性質(zhì)控 G C A T A T C A A T A A G C G G A G G A陰性質(zhì)控1 m ' C A G A T G A T T C T C G G T T A C T T G T G T C5 、正交設(shè)計(jì)優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件為：交聯(lián)微球與生物素化待測P C R 產(chǎn)物在5

5、 0 “ C 避光雜交1 小時(shí)，離心去上清后加入4 R g ／m l 的抗生物素蛋白鏈菌素一R 一藻紅蛋白溶液7 5 I - t L ，避光孵育5 分鐘，取5 0 此用于L u m i n e x l 0 0 檢測儀分析。6 、在上述優(yōu)化條件下，所建立的液相芯片檢測體系可準(zhǔn)確將5 株標(biāo)準(zhǔn)菌株和4 2 株臨床分離菌株鑒定至種的水平，除2 株臨床分離菌株因首次檢測背景熒光強(qiáng)度過高、影響結(jié)果判定而經(jīng)重復(fù)檢測得以鑒定外，其余菌株標(biāo)本均在P C