微管蛋白在顳葉癲癎模型突觸后致密物中的表達(dá)及其意義研究.pdf

1、第一部分微管蛋白在顳葉癲癇模型突觸后致密物中的動態(tài)表達(dá) 目的：探討微管蛋白α-tubulin與β-tubulin在顳葉癲癇大鼠模型突觸后致密物(PSD)中的動態(tài)表達(dá)。 方法：健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重250±20 g，200只，實驗隨機(jī)分為對照組和顳葉癲癇( TLE)組。建立氯化鋰.匹羅卡品顳葉癲癇大鼠模型，分別在癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)后1d、3d、7d、15d、30d6個時間點提取全腦組織

2、，分離PSD蛋白。應(yīng)用westernblot方法檢測β-actin、β-tubulin及GAPDH蛋白在PSD中的表達(dá)變化，確定PSD蛋白western blot半定量分析的內(nèi)參；采用western blot及免疫電鏡方法檢測微管蛋白α-tubulin與β-tubulin在PSD中的表達(dá)變化。 結(jié)果：1.氯化鋰-匹羅卡品大鼠致癇模型：SE誘發(fā)成功率為91.1％，總死亡率為20.6％，模型成功率為70.6％。 2.PSD蛋

3、白純度：NR1與PSD-95蛋白在P2成分、突觸小體及PSD中均呈免疫印跡陽性，而SynPhy蛋白在PSD成分中呈陰性。 3.顳葉癲癇大鼠PSD蛋白western blot半定量分析的內(nèi)參確定：β-actin、β-tubulin及GAPDH在對照組中均表達(dá)，β-actin及β-tubulin蛋白含量從SE后1d開始減少，SE后7d降至最低，SE后15d、30d表達(dá)有所增多，但仍低于對照組(P<0.01)。而GAPDH蛋白在SE各

4、組及對照組中的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。隨后，我們隨機(jī)選取正常對照組及SE后15天PSD蛋白兩個樣本，每個樣本置6個泳道，分別對這三個蛋白進(jìn)行分析。實驗證實與正常對照組的6個泳道蛋白相比，SE后15天6個泳道的蛋白β-actin與β-tubulin的表達(dá)均明顯減少，有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而GAPDH的表達(dá)在所有泳 道中的表達(dá)則無明顯差異(P>0.05)，提示β-actin與p-tubulin的表達(dá)變化與加量誤

5、差無關(guān)。 4.微管蛋白α-tubulin與β-tubulin在PSD的表達(dá)檢測：①α-tubulin與β-tubulin在SE后1d、3d、7d、15d、30d的表達(dá)明顯減少，SE后7d降至最低(P<0.01)，在SE后15d及30d蛋白含量較SE后7d時有所增多，但仍明顯低于對照組(P<0.01)。②免疫電鏡結(jié)果顯示在正常對照組海馬CA1中，β-tubulin蛋白在突觸前、突觸間隙、突觸后及胞漿中均有表達(dá)。與對照組比較，PSD

6、中β-tubulin在SE后1d、3d、7d、15d、30d PSD中的陽性表達(dá)顆粒明顯減少，SE后7d降至最低(P<0.01)，幾乎未見有陽性顆粒表達(dá)，SE后15d及30d表達(dá)顆粒有所增多，當(dāng)仍明顯低于對照組(P<0.01)。 結(jié)論：1.GAPDH蛋白更適合做顳葉癲癇大鼠PSD蛋白westernblot半定量研究的內(nèi)參。2.PSD蛋白tubulin參與了顳葉癲癇形成機(jī)制。 第二部分突觸后致密物微管蛋白對顥葉癲癇大鼠自發(fā)

7、發(fā)作的影響 目的：探討突觸后致密物微管蛋白α-tubulin與β-tubulin對顳葉癲癇大鼠反復(fù)自發(fā)發(fā)作形成的影響。 方法：健康成年雄性Sprague.Dawley(SD)大鼠，體重250±20g，236只，實驗隨機(jī)分為對照組、TLE自發(fā)發(fā)作(TLE-SRS)組和TLE無自發(fā)發(fā)作(TLE-NSRS)組。建立氯化鋰-匹羅卡品顳葉癲癇大鼠模型，提取全腦組織，分離PSD蛋白。采用westem blot及免疫電鏡方法檢測微管蛋

8、白α-tubulin與β-tubulin在PSD中的表達(dá)變化。 結(jié)果：1.氯化鋰-匹羅卡品致癇模型SE誘發(fā)成功率為91％，總死亡率為22％，模型成功率為72.5％，自發(fā)發(fā)作率為50.5％。TLE-SRS組大鼠EEG異常，表現(xiàn)θ節(jié)律增多及單個、多個棘波或陣發(fā)連續(xù)棘波群發(fā)放；TLE-NSRS組大鼠EEG表現(xiàn)為正?；蜉p度異常，有時可發(fā)現(xiàn)散在的棘波或尖波：生理鹽水對照組EEG亦未見癲癇樣放電波。 2.尼氏染色：與對照組比較，TL

9、E-SRS組海馬CA1、CA3區(qū)及齒狀回區(qū)均有顯著的神經(jīng)元減少(P<0.01)。CA1區(qū)和CA3區(qū)錐體細(xì)胞層神經(jīng)元排列紊亂，可見部分神經(jīng)元形態(tài)不完整，細(xì)胞腫脹或皺縮、輪廓模糊、界限不清，細(xì)胞間距加大，胞漿尼氏小體減少。齒狀回顆粒細(xì)胞邊界不整齊、排列松散、增寬，呈現(xiàn)顆粒細(xì)胞發(fā)散改變。TLE-NSRS組存活神經(jīng)元與對照組相比也有明顯減少，但較SRS組要多(P<0.01)。 3.微管蛋白α-tubulin與β-tubulin在PSD的

10、表達(dá)檢測：①與對照組比較，TLE-NSRS組α-tubulin在PSD中表達(dá)明顯減少(p<0.01)，TLE-SRS組PSD中α-tubulin含量較對照組也顯著減少(p<0.01)：與NSRS組相比，其表達(dá)水平也明顯降低(p<0.01)。②與對照組比較，TLE-NSRS組及SRS組β-tubulin在PSD中表達(dá)明顯減少(p<0.01)：與NSRS組相比，SRS組PSD中p-tubulin含量也明顯降低(p<0.01)。免疫電鏡結(jié)果顯

11、示在正常對照組海馬CA1中，β-tubulin蛋白在突觸前、突觸間隙、突觸后及胞漿中均有表達(dá)，我們將著重與突觸后致密物PSD中β-tubulin在SE后的表達(dá)變化。與對照組比較，蛋白β-tubulin在TLE-NSRS組及SRS組PSD中的陽性表達(dá)顆粒明顯減少(p<0.01)，與NSRS組相比，SRS組PSD中β-tubulin含量也明顯降低(p<0.01)。支持western blot分析結(jié)果。 結(jié)論：PSD中Tubulin蛋

12、白表達(dá)與顳葉癲癇反復(fù)自發(fā)發(fā)作呈負(fù)相關(guān)。 第三部分海馬微管穩(wěn)定性對顳葉癲癇形成的影響 目的：探討干預(yù)微管的穩(wěn)定性對顳葉癲癇形成的影響。 方法：①健康成年雄性SD大鼠，體重250±20g，75只，立體定向海馬注射不同劑量的秋水仙堿(微管解聚劑)及紫杉醇(微管聚合劑)，根據(jù)尼氏染色、免疫組織化學(xué)檢測β-tubulin的表達(dá)確定秋水仙堿及紫杉醇的最佳注射劑量。②健康成年雄性SD大鼠，體重250±20g，60只，建立氯化鋰

13、-匹羅卡品顳葉癲癇大鼠模型，在SE后7天，分別予以立體定向海馬注射最適劑量的秋水仙堿及紫杉醇，歸于秋水仙堿干預(yù)組及紫杉醇干預(yù)組。對各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)觀察及腦電圖記錄，30天后根據(jù)有無自發(fā)發(fā)作每組又分為自發(fā)發(fā)作組及無自發(fā)發(fā)作組兩亞組。采用免疫電鏡方法檢查β-tubulin在PSD中的表達(dá)。 結(jié)果：1.海馬注射秋水仙堿最適劑量的確定：①尼氏染色：與對照組相比，秋水仙堿0.01、0.03、0.1、0.3ug干預(yù)組存活神經(jīng)元數(shù)量無明顯變

14、化(p>0.05)，1.0與2.0μg治療組神經(jīng)元死亡明顯增多(p<0.01)，細(xì)胞排列紊亂，可見神經(jīng)元形態(tài)不完整，細(xì)胞腫脹或皺縮、輪廓模糊、界限不清。②免疫組織化學(xué)方法檢測發(fā)現(xiàn)對照組可見β-tubulin大量表達(dá)，主要分布在胞漿，與對照組比較，秋水仙堿0.01、0.03、0.1ug治療組β-tubulin表達(dá)無明顯差異(p>0.05)，0.3ug治療組表達(dá)減少(p<0.01).1.0與2.0ug治療組明顯減少(p<0.01)。③提示海

15、馬注射秋水仙堿的最佳劑量為0.3ug，使微管解聚，但不影響神經(jīng)元細(xì)胞的存活。 2.海馬注射紫杉醇最適劑量的確定：①尼氏染色：與對照組相比，紫杉醇0.1、0.5、1.0 ug干預(yù)組存活神經(jīng)元數(shù)量無明顯變化(p>0.05)，1.5ug治療組神經(jīng)元死亡明顯增多(p<0.01)，細(xì)胞排列紊亂，可見神經(jīng)元形態(tài)不完整，細(xì)胞腫脹或皺縮、輪廓模糊、界限不清。②免疫組織化學(xué)方法檢測發(fā)現(xiàn)與對照組比較，紫杉醇0.1、0.5 ug治療組β-tubuli

16、n表達(dá)無明顯差異(p>0.05)，1.0ug治療組表達(dá)較對照組增多(p<0.05)，但1.5ug治療組表達(dá)明顯減少(p<0.01)。③提示海馬注射紫杉醇的最佳劑量為1.0ug，使微管聚合，但不影響神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。 3.秋水仙堿0.3ug干預(yù)組及紫杉醇1.0ug干預(yù)組大鼠行為學(xué)及EEG與對照組無差異，提示秋水仙堿及紫杉醇無致癇性。 4.TLE組自發(fā)發(fā)作率為75％，秋水仙堿組自發(fā)發(fā)作率為90％，。紫杉醇組自發(fā)發(fā)作率為40％

17、。腦電圖結(jié)果顯示TLE-SRS組大鼠EEG重度異常，表現(xiàn)θ節(jié)律增多及單個、多個棘波或陣發(fā)連續(xù)棘波群發(fā)放，TLE-NSRS組大鼠EEG正?；蜉p度異常，偶見單個棘波或尖波發(fā)放，與TLE-SRS組比較，秋水仙堿-SRS組大鼠EEG無顯著差異，而紫杉醇-SRS組大鼠EEG棘尖波明顯減少，頻率及波幅均降低。秋水仙堿-NSRS組及紫杉醇-NSRS組大鼠EEG與TLE-NSRS組相比無顯著差異。 5.微管蛋白β-tubulin在PSD的表達(dá)檢