THP-1分化巨噬細(xì)胞的鈹攝入及相關(guān)生物學(xué)影響研究.pdf

1、金屬鈹(Beryllium)是最輕的穩(wěn)定金屬，具有眾多優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì)，在航空、核能、國防和電子等高科技領(lǐng)域得到應(yīng)用廣泛。然而鈹也是自然界毒性最強(qiáng)的金屬元素之一，即使是吸入微量的含鈹?shù)姆蹓m也可能會誘發(fā)慢性鈹疾病(chronic beryllium disease，CBD)。CBD是由細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)性疾病，是一種鈹特異的CD4+T細(xì)胞在疾病部位累積而維持的以肺部肉芽腫表現(xiàn)為主的全身性疾病，其結(jié)果可能是致命的。盡管鈹?shù)纳锘瘜W(xué)及CB

2、D的研究已取得一定進(jìn)展，但仍有很多關(guān)鍵性問題有待解答。例如：肺泡巨噬細(xì)胞攝入鈹?shù)闹饕緩绞鞘裁矗旊x子和哪些蛋白組成鈹抗原，鈹化合物是如何干擾免疫系統(tǒng)正常生理功能等。 基于人髓單核細(xì)胞株THP-1在佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)等化學(xué)物質(zhì)的刺激下可分化為巨噬細(xì)胞，其許多細(xì)胞化學(xué)和免疫學(xué)特征，如溶菌酶的產(chǎn)生、吞噬活性、對T細(xì)胞的免疫反應(yīng)等，都和人源的肺泡巨噬細(xì)胞非常相近，我們選擇THP-1分化

3、巨噬細(xì)胞來模擬肺泡巨噬細(xì)胞，研究鈹?shù)募?xì)胞攝入途徑及其生物學(xué)效應(yīng)。首先，我們運(yùn)用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)建立了檢測細(xì)胞鈹含量的分析方法，考察了不同鈹化合物刺激培養(yǎng)時鈹?shù)募?xì)胞攝入情況。同時應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡、免疫印跡等實驗技術(shù)，研究巨噬細(xì)胞攝入鈹之后是否引起細(xì)胞凋亡以及腫瘤壞死因子TNF-α表達(dá)的上調(diào)。全文包含以下幾個部分： 第一章：介紹鈹?shù)奈锢砘瘜W(xué)性質(zhì)、用途以及CBD免疫病理機(jī)制假說，闡述CBD病理機(jī)制研究的重

4、要性，并對相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行較為詳細(xì)的綜述，提出建立體外模型研究細(xì)胞的鈹攝入機(jī)制及其相關(guān)生物學(xué)影響的實驗構(gòu)想。 第二章：優(yōu)化人髓單核細(xì)胞株THP-1分化為巨噬細(xì)胞的條件，考察PMA濃度、刺激時間對于細(xì)胞分化的影響。從分化后巨噬細(xì)胞的形態(tài)、巨噬細(xì)胞表面CD14表達(dá)量的變化(流式細(xì)胞術(shù)分析)以及巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球的能力等幾個方面確認(rèn)THP-1的良好分化。實驗結(jié)果表明，THP-1細(xì)胞在100 ng/mL PMA的誘導(dǎo)下48小時可分化成

5、性能良好的巨噬細(xì)胞。 第三章：建立快速、靈敏的ICP-MS檢測細(xì)胞鈹含量的分析方法，考察THP-1分化巨噬細(xì)胞與不同濃度的BeO、BeSO4孵育培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)鈹?shù)臄z入量隨時間的變化情況，并通過所得數(shù)據(jù)分析鈹化合物的主要攝入途徑。實驗結(jié)果表明，100μM的BeO和BeSO4刺激培養(yǎng)48小時之后，細(xì)胞的鈹含量分別為78.2±7.6nmol/106 cells and7.2±0.5 nmol/106，BeO的攝入量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于BeSO4，

6、這說明巨噬細(xì)胞對鈹?shù)臄z入以吞噬作用為主。此外，我們也考察了轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)及細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的傳輸途徑對鈹離子的攝入影響。實驗結(jié)果顯示，transferrin在鈹離子的攝入過程中也起到了一定的重要作用。我們推測，transferrin等一些和鈹有較強(qiáng)親和力生物大分子以及這些生物分子在細(xì)胞表面的受體組成的傳輸途徑均有可能協(xié)助可溶性鈹化合物進(jìn)入細(xì)胞。 第四章：考察BeO、BeSO4的刺激培養(yǎng)，THP-1分化巨噬

7、細(xì)胞攝入鈹之后的凋亡效應(yīng)和細(xì)胞因子TNF-α分泌情況的變化。DAPI染色以及Western blotting的檢測結(jié)果表明無論是BeSO4還是BeO，THP-1分化巨噬細(xì)胞均沒有因為攝入大量鈹化合物而產(chǎn)生異常的凋亡情況，這也部分解釋了CBD為何是慢性的。同時，我們也檢測了腫瘤壞死因子TNF-α的分泌情況。加入鈹化合物48小時后，TNF-α分泌并沒有出現(xiàn)明顯上調(diào)。這些實驗結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞本身對于呼吸道攝入的鈹是比較耐受的，肺泡巨噬細(xì)胞并