A20基因?qū)-,2-O-,2-誘導的平滑肌細胞增殖及分子機制探討和中藥大黃素干預研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:血管平滑肌細胞增殖是動脈粥樣硬化(AS)及經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)術(shù)后再狹窄(RS)的重要原因,對增殖機制以及抑制其增殖的研究近年來一直是心血管領(lǐng)域的熱點。過氧化氫(H2O2)是一種體內(nèi)氧自由基,屬于活性氧家族成員之一。新近的離體研究發(fā)現(xiàn)H2O2可以通過細胞內(nèi)信號傳導途徑來影響細胞的增殖,分化和多種基因的轉(zhuǎn)錄。核因子(NF-κB)是對活性氧敏感的轉(zhuǎn)錄因子,對于促炎因子的表達起重要的作用?;钚匝跬ㄟ^氧化調(diào)節(jié)NF-κB使其活化,

2、活化的NF-κB進入細胞核,調(diào)節(jié)涉及炎癥,增殖的多個基因的轉(zhuǎn)錄。已有實驗證明以H2O2為主要代表的活性氧通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號通路激活誘導血管平滑肌細胞的增殖從而參與了AS和PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生發(fā)展。多種生長因子、細胞因子、粘附分子等參與其病理生理過程,單純抑制某種特定的因子并不能完全抑制病灶形成。因此,阻斷由H2O2損傷引起的平滑肌細胞增殖、分化、遷移、炎癥反應等最終共同的關(guān)鍵靶向轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號通路,探求內(nèi)源性細胞保護措

3、施,成為有效防止血管增生性疾病的研究方向。 鋅指蛋白A20是一種泛素調(diào)節(jié)酶,通過泛素化和去泛素化負反饋調(diào)節(jié)NF-κB信號系統(tǒng),近年研究表明鋅指蛋白A20抑制多種炎性細胞誘導NF-κB激活所引起的血管平滑肌細胞增殖,是非常重要的細胞內(nèi)源性自我保護蛋白。對于A20抗氧化損傷方面的研究甚少,本研究旨在通過采用鋅指蛋白A20基因干擾和轉(zhuǎn)染技術(shù)對其表達進行調(diào)控,觀察其對H2O2誘導的人臍動脈血管平滑肌細胞HUASMc增殖和NF-κB、酪氨

4、酸蛋白激酶Syk、細胞周期蛋白D1 CyclinD1、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P21表達及NF-κB下游炎癥因子TNF-α的影響,以探討鋅指蛋白A20在氧化還原方面對細胞的保護作用,為血管增生性疾病的防治尋求新的途徑。 方法: 1)設(shè)計并體外化學合成三條人A20的siRNA序列,通過A20mRNA及蛋白測定篩選出對人A20基因具有較高干擾效率的siRNA序列。將培養(yǎng)的HUASMc隨機分為六組:空白組(培養(yǎng)基培養(yǎng),未給

5、與任何干預);A20siRNA組(轉(zhuǎn)染A20siRNA24小時);scramble siRNA組(轉(zhuǎn)染陰性對照scramble siRNA24小時);H2O2組(100μmol/LH2O2持續(xù)刺激6小時);A20siRNA+H2O2組(轉(zhuǎn)染A20siRNA24小時后100μmol/L H2O2持續(xù)刺激6小時);scramble siRNA+H2O2組(轉(zhuǎn)染陰性對照scramble siRNA24小時后100μmol/L H2O2持續(xù)刺激

6、6小時)。應用四甲基偶氮唑藍(MTT)方法測定細胞增殖活性;流式細胞技術(shù)觀察血管平滑肌細胞細胞周期的變化;RT-PCR方法觀察A20mRNA表達變化;Western-blotting方法觀察A20、NF-κB p65、Syk、CyclinD1、P21蛋白含量表達。雙抗體夾心ELISA方法檢測上清液TNF-α表達水平; 2)pCAGGS-GFP/A20質(zhì)粒菌保涂Amp抗性的平板后,過夜培養(yǎng)。挑單菌落于3ml Amp抗性的LB培養(yǎng)基

7、中37℃搖床中過夜培養(yǎng),集菌后,進行小量質(zhì)粒提取,并使用EcoRⅤ/SmaⅠ進行雙酶切鑒定,酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳。將鑒定好的質(zhì)粒菌保進行無內(nèi)毒素質(zhì)粒的大量提取,將質(zhì)粒DNA提取物按適當比例稀釋,并測定濃度。將培養(yǎng)的HUASMc隨機分為四組:空白組(為空白對照組,不加任何干預因素);H2O2組(在培養(yǎng)基100μmol/L的H2O2作用6小時);A20組(向HUASMc轉(zhuǎn)染含A20基因的質(zhì)粒后培養(yǎng)24小時);A20+H2O2組(先向H

8、UASMc轉(zhuǎn)染含A20基因的質(zhì)粒,培養(yǎng)24小時后在培養(yǎng)基中加入100μmol/L的H2O2作用6小時)。應用四甲基偶氮嘩藍(MTT)方法測定細胞增殖活性;流式細胞技術(shù)觀察血管平滑肌細胞細胞周期的變化;Western-blotting方法觀察NF-κB p65、Syk、CyclinD1、 P21蛋白含量表達。雙抗體央心ELISA方法檢測培養(yǎng)液TNF-α表達水平; 3)體外培養(yǎng)HUASMc,以H2O2作為刺激因素,以不同濃度大黃素(

9、EMD)作為干預因素,采用MTT比色、BrdU摻入法測定細胞增殖;采用RT-PCR方法檢測A20mRNA表達水平;采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測A20、NF-κB蛋白表達的變化。 結(jié)果: 1)與對照組比較,轉(zhuǎn)染A20siRNA的HUASMc中A20mRNA及蛋白表達水平明顯降低,以siRNAc最顯著,干擾效率大約55%,MTT結(jié)果顯示H2O2可誘導HUASMc增殖,H2O2后A20干擾對平滑肌細胞增殖活性有協(xié)同作用。流式檢測結(jié)果

10、表明H2O2組S期、G2/M期構(gòu)成百分比,增殖指數(shù)均較空白組明顯增加;與H2O2組比較,H2O2+A20干擾后,細胞S期構(gòu)成比和增殖指數(shù)明顯升高。H2O2刺激后A20mRNA與A20蛋白、NF-κB p65、Syk、cyclinD蛋白表達增加; P21蛋白表達量降低。A20干擾后使H2O2引起的上述變化趨勢更加顯著。雙抗體夾心ELISA結(jié)果示培養(yǎng)的細胞液中A20干擾后增加了H2O2所誘導的NF-κB p65下游的細胞炎癥因子TNF-α表

11、達水平; 2)將提取的重組真核表達質(zhì)粒pCAGGS-GFP/A20使用EcoRⅤ/SmaⅠ進行雙酶切鑒定,酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳,質(zhì)粒大小及酶切結(jié)果正確。轉(zhuǎn)染含A20基因質(zhì)粒的HUASMc MTT細胞增殖活性降低,阻止細胞由G0/G1期進入S期,有效抑制H2O2刺激的HUASMc增殖。明顯抑制H2O2所誘導的NF-κB p65、Syk、CyclinD、TNF-α蛋白表達的增高。顯著逆轉(zhuǎn)H2O2引起的P21蛋白含量的下調(diào);

12、 3)在10~80μmol·L-1范圍內(nèi),隨EMD濃度加大,MTTOD值及BrdU摻入OD值均逐漸變小,對H2O2誘導的HUASMc增殖具有抑制作用,且呈劑量依賴性。同時可呈劑量依賴性使HUASMc中A20mRNA和蛋白表達增加,NF-κBp65蛋白表達減少。 結(jié)論: 1)H2O2可誘導體外培養(yǎng)的HUASMc增殖及炎癥反應,激活Syk/NF-κB信號通路,上調(diào)Syk、NF-κB p65、CyclinD1的表達,下調(diào)P

13、21表達,促進炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生; 2)A20siRNA干擾可以抑制HUASMc內(nèi)源性A20mRNA和蛋白表達,具RNAi作用; 3)A20干擾可減弱內(nèi)源性A20對H2O2/Syk/NF-κB p65信號通路的負反饋抑制作用,上調(diào)Syk、NF-κB p65、CyclinD1表達,下調(diào)P21表達,增加炎癥因子TNF-α表達,增強H2O2刺激引起的HUASMc增殖活性及炎癥反應; 4)A20基因轉(zhuǎn)染可上調(diào)細胞內(nèi)

14、A20的表達,增強對H2O2/Syk/NF-κB p65信號通路負反饋抑制作用,下調(diào)CyclinD1表達,上調(diào)P21表達,改善細胞周期蛋白/細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的平衡關(guān)系,減少炎癥因子TNF-α產(chǎn)生,從而達到抑制氧化應激損傷所引起的VSMC增殖及炎癥反應; 5)干預A20可能成為防治動脈粥樣硬化的新靶點,上調(diào)A20可能成為防治動脈粥樣硬化性疾病的新方法; 6)EMD對H2O2誘導的HUASMc增殖具有抑制作用,其

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